新疆哈萨克族人神经前体细胞表达发育调控样蛋白4基因rs3865418多态性与中心性肥胖的相关性

王红梅，洪 静，罗文利，常建航，姚晓光，李南方

1新疆医科大学 研究生院，乌鲁木齐 830054

2新疆维吾尔自治区人民医院高血压诊疗研究中心 新疆高血压诊疗研究中心，乌鲁木齐 830001

超重、肥胖是高血压、糖尿病、冠心病等心血管相关疾病的重要危险因素，目前认为是由基因和环境等因素相互作用引起的。研究表明，人体脂肪容量的变异约有40%归因于遗传因素［1-2］。神经前体细胞表达发育调控样蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like，NEDD4L)是泛素-蛋白酶体途径的重要组成部分，可能参与了肥胖的发生、发展过程［3-5］。近年来，一些研究也证实了NEDD4L的rs3865418多态性与白人、黑人和中国汉族人群的高血压相关［6-9］。但上述研究还发现rs3865418多态性的T等位基因与希腊白人的高血压发病相关，而C等位基因与美国白人的高血压发病相关，即是所谓的“反转” (flip-flop)现象，提示在一个人群中是高危致病因素的等位基因，在另一个人群中反而是保护性因素［8］。主要居住在新疆牧区的哈萨克人是肥胖高发民族［10］;此外，由于该民族极少与外界通婚，至今仍保留有相对完整的隔离人类遗传体系，是研究肥胖等多基因复杂疾病的理想人群。目前，rs3865418多态性与该民族肥胖的关联研究相关报道较少，因此，本研究采用TaqMan PCR法对该基因的rs3865418多态性在哈萨克族自然人群中进行分型，分析其与哈萨克族肥胖的相关性，从遗传学角度探讨肥胖的易感机制，以期为肥胖的防治提供参考依据。

对象和方法

对象 采用多级随机抽样的方法，对阜康地区有本地正式户口、30～60岁、三代内无异族通婚史的长住哈萨克族居民进行流行病学现况调查。调查前事先登记人口，保证应答率，保证入选个体均为无关个体，最后共有856例 (男性364例、女性492例)入选本研究。所有研究对象均签署知情同意书。本研究通过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会审查并同意实施。

方法 以自然人群横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究。采用问卷调查方法，调查工作主要由经过统一培训的、精通哈萨克萨克语的专职人员填写表格、询问病史、体格检查。所有研究对象均收集一般资料，包括性别、年龄、腰围、收缩压、舒张压等。每位研究对象均抽取空腹状态下全血5 ml，现场离心分离血清和血液有形成份，血清在采血后1个月内检测血脂等生化指标，血液有形成份在－80℃保存，以提取DNA。生化检测均在新疆维吾尔自治区人民医院 (三级甲等医院)检验科完成并由专人负责。按《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》［11］标准诊断中心性肥胖，即男性腰围≥85 cm、女性腰围≥80 cm者为中心性肥胖，按此标准，856例研究对象中肥胖组共478例、对照组共378例。

哈萨克族人外周血基因组DNA提取 采用PAXgene Blood DNA试剂盒 (QIAGEN，Hilden，Germany)，并按照试剂盒中提供的“操作说明”中的标准操作步骤提取研究对象的外周血基因组DNA。

哈萨克族人群中基因分型 采用Taqman PCR技术，使用 ABI 7900HT(Applied Biosystems，Foster City，California，USA)对856例研究对象进行基因分型。PCR的反应体系:总体积25 μl，其中人类Taq-Man基因多态性分型预混液 (Applied Biosystems，Foster City，California，USA)12.5 μl、单核苷酸多态性分型探针/引物预混液 (Applied Biosystems，Foster City，California，USA)1.25 μl、DNA 模板 (20 ng/μl)2 μl、去离子水 9.25 μl。反应条件:预变性 (95℃、10 min、1个循环)，变性 (92℃、15 s)+退火 (60℃、1 min)+延伸 (72℃、1 min)43个循环，总延伸(72℃、7 min、1个循环)。

统计学处理 采用SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)统计软件包进行数据处理。计量资料用均数±标准差表示，计数资料采用百分数表示。组间临床表型计量资料比较采用t检验 (两组间)或单因素方差分析 (三组间)，分类资料采用卡方检验。由基因型频率计算等位基因频率，Hardy-Weinberg平衡检验、两组间等位基因频率和基因型频率比较采用专业的遗传学分析软件SNPAlyze Ver.7.0.1 pro(日本)进行分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

基因分型 对rs3865418多态性在851例哈萨克族自然人群中成功进行了基因分型，另有5例分型未成功，基因分型的读取率99.4%，重复检测一致率100%。肥胖组、对照组的基因型、等位基因频率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡 (肥胖组 χ2=0.743，P=0.389;对照组 χ2=0.173，P=0.967)。

临床特征 与对照组比较，肥胖组的平均年龄、收缩压、舒张压、腰围、总胆固醇、三酰甘油水平增高，且差异具有统计学意义 (P＜0.05);但两组间吸烟、饮酒者比例的差异无统计学意义 (P＞0.05)(表1)。

rs3865418多态性与哈萨克族人肥胖的相关性

在总体、男性、女性哈萨克族自然人群中，rs3865418多态性的基因型 (包括累加模型、显性模型和隐性模型)、等位基因在肥胖组及对照组分布差异无统计学意义 (P＞0.05)(表2)。在总体哈萨克族自然人群中，C/C、C/T、T/T 3种基因型携带者的腰围差异无统计学意义 (P＞0.05);男性腰围平均水平有C/C携带者＞C/T携带者＞T/T携带者的趋势，而女性腰围平均水平有C/C携带者＜C/T携带者＜T/T携带者的趋势，但差异无统计学意义 (P＞0.05)(表3)。

表1 肥胖组及对照组临床资料比较Table 1 Basic characteristics of subjects in obesity group and normal control group

表2 rs3865418多态性基因型、等位基因在肥胖组及对照组间分布频率 (n)Table 2 Genotype and allele distributions of rs3865418 polymorphism in obesity group and normal control group(n)

表3 不同基因型腰围的比较 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

表3 不同基因型腰围的比较 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

基因型Genotypes 总体Total 男性Male 女性Female C/C 84.09±11.619 88.54±11.775 80.39±10.119 C/T 83.54±12.425 87.51±12.615 80.72±11.510 T/T 84.78±12.581 86.19±12.308 83.89±12.743 P 0.572 0.471 0.050

讨 论

泛素-蛋白酶体途径是真核生物内主要的蛋白质降解系统 (70%～80%)。除此之外，该系统也介导、调节核因子κB的激活过程［3］。核因子κB是重要的炎性转录因子并控制白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-a等炎性细胞因子及一些黏附因子的转录过程［4］。研究表明非特异性系统性炎症在肥胖的发生、发展中发挥着重要作用［5］。因此，泛素-蛋白酶体途径可能参与肥胖的发病过程。除泛素外，泛素-蛋白酶体途径还包括4种酶家族:泛素活化酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶及蛋白酶体，它们均以多种异构体形式存在。NEDD4L是泛素蛋白连接酶家族成员，故从其生理功能角度来看，NEDD4L是肥胖的候选基因。

本研究证实rs3865418多态性可能与新疆哈萨克族自然人群中心性肥胖不相关。但是本研究这个阴性研究结果并不是因为检验效能不足所导致的 (本研究检验效能为0.962)。此外，关联研究中的假阴性结论的主要原因是受混杂因素的干扰。在诸多混杂因素中，一个极其重要但又常被忽视的因素即是群体的遗传分层现象，这往往由于遗传背景不一的亚人群混合所致，其产生机制复杂，可能与各亚人群祖先的迁移模式、婚配习惯、生殖强弱及基因组的随机突变等因素有关。群体分层对遗传关联分析的直接影响是可能导致结果偏倚，产生假阴性的结果。正因如此，很多关联研究的结果难以在不同人群的研究中得到重复。因此在进行病例对照的关联研究时，尽可能排除群体分层的干扰尤为重要，如加大样本量并尽可能的选择一个遗传上相对均质的群体等。本研究样本均来自于一个遗传上相对均质的相对隔离群体，研究样本量较大，而且该人群中rs3865418多态性的基因型、等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡，因此本研究结论是相对可信的。但在今后的研究中尚需要进一步扩大样本量及在其他民族人群中验证。

本研究虽然未显示rs3865418多态性与哈萨克族人群肥胖相关，但是显示男性腰围平均水平有C/C携带者＞C/T携带者＞T/T携带者的趋势，而女性腰围平均水平有C/C携带者＜C/T携带者＜T/T携带者的趋势，尽管上述差异无统计学意义，但也提示在新疆哈萨克族人群中rs3865418多态性可能存在不同性别间的“反转” (flip-flop)现象，因此尚需要扩大样本量进一步研究。既往的研究发现NEDD4L的rs3865418多态性与高血压的关联存在“反转”(flip-flop)现象［6-9］，即在一个人群中是高危致病因素的等位基因，在另一个人群中反而是保护性因素［8］。分析其原因可能是 rs3865418多态性变异位于NEDD4L的内含子区，因其并未引起编码氨基酸的改变而不是传统意义上的“致病突变”，故其与疾病是否相关可能是取决于该变异是否与其他与疾病相关的功能性变异间存在连锁不平衡:即在某一人群中当其T等位基因与致病变异连锁时，可以表现为致病因素;当与保护性变异连锁时，表现为保护性因素;当与功能性变异不连锁时，表现为与疾病不相关;因此尚需要进一步深入研究位于此位点周围的、可能与其存在连锁不平衡关系的NEDD4L变异及周围其他基因的变异与疾病的关系。

综上，本研究通过探讨NEDD4L变异与哈萨克族人群肥胖的关系，发现rs3865418多态性可能与哈萨克族人群肥胖不相关。在此后的研究中，尚需扩大样本量及在其他民族人群中验证，并且此位点周围的其他的NEDD4L变异及周围其他基因的变异与肥胖的关系尚需要进一步研究。

［1］Shuldiner AR，Munir KM.Genetics of obesity:more complicated than initially thought［J］.Lipids，2003，38(2):97-101.

［2］Comuzzie AG，Allison DB.The search for human obesity genes［J］.Science，1998，280(5368):1374-1377.

［3］Palombella VJ，Rando OJ，Goldberg AL，et al.The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa B1 precursor protein and the activation of NF-kappa B［J］.Cell，1994，78(5):773-785.

［4］Willerson JT，Ridker PM.Inflammation as a cardiovascular risk factor［J］.Circulation，2004，109(21 Suppl.1):Ⅱ2-Ⅱ10.

［5］Das UN.It is suggested that metabolic syndrome X is a lowgrade systemic inflammatory condition ［J］.Exp Biol Med，2002，227(11):989-997.

［6］Araki N，Umemura M，Miyagi Y，et al.Expression，transcription，and possible antagonistic interaction of the human Nedd4L gene variant implications for essential hypertension［J］.Hypertension，2008，51(3):773-777.

［7］Wen H，Lin R，Jiao Y，et al.Two polymorphisms in NEDD4L gene and essential hypertension in Chinese Hans-a population-based case-control study ［J］.Clin Exp Hypertens，2008，30(2):87-94.

［8］Russo CJ，Melista E，Cui J，et al.Association of NEDD4L ubiquitin ligase with essential hypertension ［J］.Hypertension，2005，46(3):488-491.

［9］Manunta P，Lavery G，Lanzani C，et al.Physiological interaction between α-adducin and WNK1-NEDD4L pathways on sodium-related blood pressure regulation［J］.Hypertension，2008，52(2):1-7.

［10］李南方，周玲，曹梅，等.新疆和丰县牧区高血压病流行病学调查报告 ［J］.现代预防医学，2003，30(2):141-143.

［11］陈春明，孔灵芝.中国成人超重和肥胖症预防控制指南［M］.北京:人民卫生出版社，2006:3.