六味地黄汤相关苷类单体对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的研究

刘继平，兰洲，傅强，罗建光，马世平，孔令义

(1.中国药科大学，江苏 南京 210009;2.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

细胞增殖反应是常用的免疫反应评价指标，机体内或体外培养的淋巴细胞在受到有丝分裂原等刺激后，可致细胞活化、细胞因子合成、细胞因子受体表达、细胞分化及细胞增殖等细胞行为的变化。由于检测手段具有可靠性、良好的重复性及简便性等特点，故通过测定细胞增殖反应来判断免疫细胞的功能一直得到广泛的应用。免疫调节是六味地黄汤重要作用之一，以往研究均是对全方在免疫调节方面的研究，有关其免疫调节有效组分研究的报道很少。苷类成分是六味地黄汤方中重要活性成分，本实验采用脾淋巴细胞增殖反应，初步评价六味地黄汤中5种代表性苷类成分的免疫活性。

1 材料

1.1 动物

ICR小鼠，体质量(20±2)g，清洁级，南通大学实验动物中心，合格证号:SCXK(苏)2008－0010。饲养环境:中国药科大学中药药理实验室，动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温(22±1)℃，自由饮水摄食。

1.2 药物和试剂

芍药苷、马钱苷、莫诺苷、桃叶珊瑚苷、薯蓣皂苷元标准品(中国药品生物制品检定所，均用DMSO配成10－2mol/L，微孔滤膜过滤，再用培养基配成 10－5、10－6、10－7mol/L);RPMI－ 1640 培养基、小牛血清(JIBCO)，MTT、LPS、ConA(Sigma)，DMSO(国药集团化学试剂公司)。

1.3 主要仪器

NOVAPHTHTM酶标仪 (美国Bio－Rad公司);CO2培养箱(Thermo);XD－202倒置显微镜(江南);超净工作台(Boxun);BS110S电子分析天平(Sartorius);离心机(湘仪);贝克曼高速离心机。

2 方法［1］

2.1 脾淋巴细胞的制备

ICR小鼠脱臼处死，置75%酒精灭菌，取出脾脏置培养皿里，加3ml PBS冲洗，剔除脂肪和结缔组织，弃去PBS，另加入5mL PBS，剪碎脾脏，吸取PBS液，经尼龙布(100目)滤网过滤至10mL离心管中，4℃，1 000rpm离心10min，使细胞沉淀，弃去上清液，加入3mL红细胞裂解液，3min后，离心，弃去上清液，加PBS洗涤2次后，加入RPMI－1640培养液(10%小牛血清)5mL，悬浮脾细胞，作细胞计数及测定细胞的存活率，并调整细胞浓度为1×106个/mL。将收获的淋巴细胞用台盼蓝染色，检测细胞存活率≥95%，即可用于实验。以上操作过程，细胞均在0～4℃放置。

2.2 脾淋巴细胞增殖试验

实验组有静息期细胞对照组、各浓度药物直接刺激组、丝裂原刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞组、丝裂原脂多糖(LPS)刺激B细胞组。

实验时每孔均加入2×106个/mL淋巴细胞100μL。然后实验组加入不同浓度六味地黄汤苷类单体，对照组加入相同体积的RPMI－1640完全培养液。丝裂原刺激分别加入终浓度为5μg/mL的ConA或10μg/mL的LPS。每个样本均设6个复孔。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养44h后加入MTT 20μL使其终浓度为0.5mg/mL，继续培养4h。取出，1 500rpm离心10min，弃上清 100μL，再加入 DMSO 100μL 轻微振荡10min，酶标仪490nm波长测每孔OD值。实验重复3次。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 不同浓度芍药苷对淋巴细胞增殖作用的影响

10－5M芍药苷能显著促进淋巴细胞增殖，对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的协同作用，10－7～10－6M芍药苷对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显协同作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。结果见表1。

表1 芍药苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(n=6)

3.2 不同浓度薯蓣皂苷元对淋巴细胞增殖作用的影响

10－6～10－5M薯蓣皂苷元能促进淋巴细胞增殖，对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有协同作用，10－7M薯蓣皂苷元对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有协同作用，但与对照组比较均无显著性差异。结果见表2。

表2 薯蓣皂苷元对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(n=6)

3.3 不同浓度马钱苷对淋巴细胞增殖作用的影响

10－7～10－5M马钱苷能显著促进淋巴细胞增殖，10－7M马钱苷对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有显著协同作用，随剂量增加，增殖作用反而降低。结果见表3。

表3 马钱苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(n=6)

3.4 不同浓度莫诺苷对淋巴细胞增殖作用的影响

10－7～10－5M莫诺苷能显著促进淋巴细胞增殖，对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的协同作用，对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显协同作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。结果见表4。

表4 莫诺苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(n=6)

3.5 不同浓度桃叶珊瑚苷对淋巴细胞增殖作用的影响

10－7～10－5M桃叶珊瑚苷基本无促进淋巴细胞增殖作用，10－5M桃叶珊瑚苷对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的协同作用，10－7～10－5M桃叶珊瑚苷对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显协同作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。结果见表5。

表5 桃叶珊瑚苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(n=6)

4 讨论

淋巴细胞是机体的重要免疫细胞，淋巴细胞转化实验是检测淋巴细胞增殖活性的一种有效的方法，常用于评价药物对机体免疫功能的影响。ConA可以诱导T淋巴细胞表达IL－2受体，使T淋巴细胞活化。LPS是B细胞的多克隆激活剂，直接刺激B细胞发生有丝分裂。

六味地黄汤的免疫调节是其重要作用之一，脾脏淋巴细胞转化增殖增强是其作用机理之一，以往研究均是对全方在免疫调节方面的研究，有关其免疫调节有效组分研究的报道很少，苷类成分是六味地黄方中重要活性部位。芍药苷具有抗炎、免疫调节作用［2－4］。尤其是对自身免疫性疾病的治疗有着积极的作用。本实验中芍药苷在较高浓度对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显协同作用，而在低浓度对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显的协同作用。乔善义［5］在研究中发现，莫诺苷具有促进脾细胞增殖作用，而近年来研究主要集中在神经保护方面，本实验发现莫诺苷能够显著促进淋巴细胞增殖，且对LPS诱导的B淋巴细胞和ConA诱导的T淋巴细胞均有明显增殖作用。马钱苷作为山茱萸中环烯醚萜类的主要成分，具有免疫调节、抗休克等作用。无论在体内与体外，适当浓度的马钱子苷能促进淋巴细胞转化，高浓度时则有抑制作用，提示马钱子苷对免疫反应有双相调节作用［6］。赵武述等［7］在研究中也发现，无论是体外还是体内实验，合适浓度的马钱子苷对淋巴细胞转化、IL－2产生、LAK细胞生成均有促进作用，高浓度时则有抑制作用。本实验中，马钱苷仅在10－7M浓度对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有协同作用，浓度增高反而抑制，与文献报道基本一致。桃叶珊瑚苷和薯蓣皂苷元未见免疫方面报道，本实验结果表明，桃叶珊瑚苷在较高浓度对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显协同作用，而在各浓度条件下对ConA诱导的T淋巴细胞均有明显增殖作用;薯蓣皂苷元在10－6～10－5M范围内对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显协同作用。本实验结果为进一步深入研究六味地黄汤免疫调节作用，寻找高活性、高选择性免疫调节剂打下了基础。

［1］王敏，刘旭平，张建勤，等.黄芩苷对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响［J］.江西医学院学报，2007，47(6):17 －19.

［2］Tang NY，Liu CH，Hsieh CT，et al.The anti－ inflammatory effect of paeoniflorin on cerebral infarction induced by ischemia－reperfusion injury in Sprague － Dawley rats［J］.The American journal of Chinese medicine，2010，38(1):51 －64.

［3］Tsuboi H，Hossain K，Akhand AA，et al.Paeoniflorin induces apoptosis of lymphocytes through aredox － linked mechanism［J］.J Cell Biochem，2004，93(1):162 －172.

［4］Wu H，Wei W，Song L，et al.Paeoniflorin induced immunetolerance of mesenteric lymph node lymphocytes via enhancing beta 2－adrenergic receptor desensitization in rats with adjuvant arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2007，7(5):662 －73.

［5］乔善义.六味地黄汤醇溶部位免疫活性成分研究多糖构效关系的初步研究［D］.北京:军事医学科学院，1999:1－14.

［6］付桂香，李建民，周勇，等.山茱萸总苷抗炎免疫抑制作用及其机理的大鼠实验研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(4):314－320.

［7］赵武述，张玉琴，赵世萍，等.山茱萸成分的免疫活性研究［J］.中草药，1990，21(3):113 －116.