熊果酸联合供者特异性淋巴细胞输注诱导小鼠免疫耐受

刘勇 李尧 黄霞 李超 薛承彪 胡昕鹏 杨涛 周平

核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是 T 细胞活化重要信号分子。我们前期研究发现T细胞特异性 NF-κB 活化障碍小鼠——IκBαΔN-Tg 小鼠，能够永久接受异基因心脏移植物。本研究将探讨以NF-κB为干预靶点的小分子化合物——熊果酸对小鼠异基因心脏移植的影响。

实验方法如下:(1)流式细胞术分选获取C57BL/6(B6)脾脏T细胞并于体外培养。实验分3组:对照组仅加入T细胞;单克隆抗体(简称单抗)刺激组同时加入2 μg/mL抗CD3单抗和1 μg/mL抗CD28单抗;单抗刺激+熊果酸组在加入单抗前将 T 细胞与5、10、25 μmol熊果酸各孵育2 h。单抗刺激24 h后检测p65核转位程度，48 h后检测T细胞表面CD25、CD69表达以及培养上清液中IL-2水平。(2)建立BALB/c到B6或RAG-/-(T细胞和B细胞缺陷)的腹部心脏移植模型。分为5组:空白对照组仅行心脏移植;溶剂对照组使用0.5%羧甲基纤维素钠灌胃;供者特异性淋巴细胞输注(donor specific transfusion，DST)组在移植成功后立即给予DST(1.0×107BALB/c脾脏细胞，自眼球后输入);熊果酸组自术前1 d至术后14 d每天给予20 mg/kg熊果酸灌胃;熊果酸联合DST组采用前述两种措施。(3)二次心脏移植。采用颈部心脏移植，受体为移植心脏长期存活小鼠(long time survival，LTS)，供体分别为BALB/c和C3H小鼠。(4)过继输注。1×107B6脾脏细胞、1×107LTS脾脏细胞、1×107B6脾脏细胞+1×107LTS脾脏细胞分别输注给移植了BALB/c心脏的RAG-/-小鼠;1×107排斥了BALB/c移植心脏的B6小鼠(简称Rej)脾脏细胞输注给移植了BALB/c心脏的RAG-/-小鼠和LTS。(5)术后观察。每天扪诊心脏，观测移植心脏存活时间;检测术后7 d LTS脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例;INF-γ酶联免疫斑点法检测各组细胞对不同抗原的反应性。

结果:(1)单抗刺激24 h后T细胞核内NF-κB p65 上升，而 5、10、25 μmol的熊果酸分别将其下调。48 h后25 μmol的熊果酸将单抗刺激后T细胞表面CD25下调92.4%，CD69下调89.3%;上清液中 IL-2 浓度上升，5、10、25 μmol的熊果酸分别将其下调。(2)移植心脏平均存活时间空白对照组与溶剂对照组相似，DST组延长，20 mg/kg熊果酸可将其延长至(36.8±0.6)d，熊果酸联合 DST可使84.6%的移植心脏存活超过150 d。(3)二次心脏移植时，LTS可持续(＞100 d)不排斥BALB/c心脏，而在14 d内排斥C3H心脏。LTS脾脏细胞对C3H抗原反应正常，而对BALB/c抗原反应降低。术后7 d时脾脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例熊果酸联合DST组与LTS相似。排斥反应发生时间联合移植LTS和B6脾脏细胞与单纯输注B6脾脏细胞无明显差异，LTS接受Rej脾脏细胞后与RAG-/-小鼠输注Rej脾脏细胞后也无明显差异。

综上结果，熊果酸可剂量依赖性地抑制抗CD3、CD28单抗促发的T细胞NF-κB核转位和T细胞活化。短期应用熊果酸辅以手术当天DST能诱导供者特异性小鼠移植心脏免疫耐受，而CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞作用及其他调节机制并非该耐受模型的主要机制。

相关研究 Ursolic acid promotes robust tolerance to cardiac allografts in mice由华中科技大学同济医院器官移植研究所周平(pzhou@tjh.tjmu.edu.cn)团队完成，全文将发表于Clinical and Experimental Immunology 2011年第2期。