应用免疫抑制剂及中药康脉胶囊抑制家兔血管支架植入后早期再狭窄的实验研究

姚家琪，孙秋，李晓陵，尹志伟，刘松江，高杰，李令根

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

血管内支架的临床应用经历了20多年的不断更新和发展，我们经历了金属支架、聚合物支架、涂层支架(包括药物涂层支架)、放射性支架、生物可降解支架、载基因血管支架等等。随着支架材质的改良、制造工艺的完善、临床技术的提高，支架的生物相容性、机械力学性能、抗腐蚀性和血液相容性也得到了明显的提高，取得了令人可喜的成绩。但是由于以上血管内支架仍存在这样或那样的缺陷，血管内支架再狭窄(in－stent restenosis，ISR)问题一直存在并没有解决。血管内支架如若植入人体或生物体，那么血管内支架对人体以及生物体来说便是异物，而抗原的免疫原性的本质是异物性。在免疫功能正常的条件下，具有异物或同种异物原性的物质皆能诱导宿主的正免疫应答。基于以上考虑，我们提出了免疫抑制剂环孢素注射液及中药康脉胶囊对防治ISR的可能性这样一个研究课题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

20只体质量2.4～2.6kg的健康新西兰大白兔，均为雄性。实验用试剂盒选用SP－9001/9002 Histostain TM－Plus Kits免疫组化染色试剂盒;抗体选用Mouse－Anti－PCNA增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA);Rabbit－Anti－VEGF 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth fator，VEGF);Rabbit－Anti－CDK2细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin－dependent kinase 2，CDK2);Rabbit－Anti－P21细胞周期调控蛋白(p21Cip1)。实验用血管内支架选用德国amg医学科技发展有限公司的冠状动脉植入裸金属支架(球囊膨胀展开式)，血管内支架直径:3.0mm血管内支架长度:10mm～18mm。实验用药物选用瑞士诺华制药有限公司生产的免疫抑制剂环孢素注射液，商品名:山地明注射液 ;规格:5mL:250mg×10支。康脉胶囊由哈尔滨大中药业制药厂提供。

1.2 实验方法

新西兰大白兔20只，雄性，体质量2.4～2.6kg血管内支架植入前正常饲料适应性饲养1周，然后进行血管内支架植入术。16只成功植入髂动脉血管支架的家兔被随机分成4组。1)裸支架组;2)环孢素组;3)康脉胶囊组;4)环孢素+康脉胶囊组。用20%乌拉坦5mL/kg经家兔耳缘静脉麻醉，用1%利多卡因4～5mL髂动脉区局部麻醉。制备家兔髂动脉血管支架内再狭窄模型。

1.2.1 实验用药物用量及配制方法 免疫抑制剂:环孢素注射液的配制:250mg/5mL使用前先用生理盐水稀释成250mg/25mL，配好的制剂保存于4℃冰箱，使用前先复温至室温，摇匀后以备注射用。中药康脉胶囊:根据前期家兔动物实验研究康脉胶囊用量为0.56粒/kg，用生理盐水稀释成10mL/kg，以备灌胃。

1.2.2 各组用药剂量及时间分配 用药组给药剂量:按照体表面积计算［1］。裸支架组:正常饲养直到处死;环孢素组:血管内支架植入后，第1～5天(冲击量)，按7倍于人环孢素注射液用药剂量(人环孢素注射液用药按7.5mg/kg/d剂量计算)，则家兔环孢素肌肉注射液用药量为7.14mg/kg/d。第6～14天，按相当于人环孢素注射液用药7.5mg/kg/d剂量计算，则家兔肌肉注射环孢素注射液用药量剂量为1.02mg/kg/d。第15～28天，按相当于人环孢素注射液用药5mg/kg/d剂量计算，则家兔肌肉注射环孢素注射液用药量剂量为0.678mg/kg/d。康脉胶囊组:血管内支架植入后，每日早晨进食前30～60min用胃管按168mg/kg灌入康脉胶囊稀释液，每日1次连续用药、正常饲养至取材日。环孢素+康脉胶囊组:血管内支架植入后，家兔环孢素注射液肌肉注射用量、方式及时间同环孢素组。每日康脉胶囊稀释液灌胃用量、时间同康脉胶囊组。

1.2.3 造影及取材 术后4周各组含血管支架家兔髂动脉造影。麻醉处死家兔，无菌取出含血管支架的家兔髂动脉血管(包含上下相邻5mm血管段)，一分为二。一部分用4%的多聚甲醛固定，经脱水、透明、石蜡包埋以备HE染色、免疫组化染色;另一部分用前固定液3%戊二醛固定以备扫描电镜观察。

1.3 统计学处理

应用SPSS 16.0软件包完成数据的统计处理。数据结果用均数±标准差(±s)表示，多个均数的比较用单因素方差分析(one Way ANOVA)。方差齐性检验时，均数的多重比较用LSD检验。方差不齐时，均数的多重比较用基于t检验的保守的多重比较(Tamhane＇sT2)。

2 实验结果

2.1 血管内支架植入后各实验组家兔髂动脉狭窄血管造影定量分析

分别测量各实验组家兔血管内支架植入前基础血管直径、家兔血管内支架植入后即刻血管直径、家兔血管内支架植入后即刻血管直径与基础血管直径比、28天后家兔血管直径狭窄百分比见表1。各对比组家兔28天血管造影定量分析利用多个均数的比较单因素方差分析(one Way ANOVA)P值结果(见表2)。以上结果显示，各组家兔右髂动脉血管直径均有不同程度狭窄，但是以裸支架组和康脉胶囊组血管腔直径狭窄明显，而环孢素组和环孢素+康脉胶囊组血管腔直径狭窄较轻。

表1 各组家兔髂动脉28天血管造影定量分析(±s)

表1 各组家兔髂动脉28天血管造影定量分析(±s)

2.44 ±0.02 2.49 ±0.15 2.48 ±0.03 2.49 ±0.02血管内支架植入后即刻管径(mm) 2.86 ±0.02 2.90 ±0.01 2.88 ±0.02 2.88 ±0.01血管内支架植入后即刻管径/基础管径 1.17 ±0.01 1.16 ±0.01 1.16 ±0.01 1.16 ±0.01 28 天后血管直径(mm) 1.21 ±0.05 2.17 ±0.03 1.25 ±0.04 2.21 ±0.03 28 天后血管管径丢失(mm) 1.23 ±0.03 0.27 ±0.02 1.23 ±0.04 0.25 ±0.08 28天后血管直径狭窄百分比(%)康脉胶囊组基础血管直径(mm)裸支架组 环孢素A组 康脉胶囊组 环孢素A+50.4 ±1.70 10.9 ±0.70 49.7 ±1.70 10.0 ±3.11

表2 各对比组间家兔28天后血管造影P值比较

2.2 血管内支架植入后各实验组家兔髂动脉28天后扫描电镜比较

扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)分别用1 000和2 000倍率拍片记录。扫描电镜观察结果显示，应用免疫抑制剂环孢素注射液和环孢素注射液+康脉胶囊实验组，血管内支架的内皮细胞更接近于正常内皮细胞。提示应用免疫抑制剂环孢素注射液和环孢素注射液+康脉胶囊可以干预和预防血管内皮细胞由于血管内支架植入后引起的免疫排斥反应。从血管内皮细胞微绒毛结构分布形态观察，环孢素+康脉胶囊组新生血管内膜表面血管内皮细胞更接近正常细胞，说明中药康脉胶囊与免疫抑制剂环孢素联合应用具有积极协同作用。

2.3 各实验组家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对 PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1 蛋白表达影响

28天后各组实验家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响结果见表3。各对比组家兔多个均数的比较单因素方差分析(one Way ANOVA)P值结果(见表4)。在本实验研究中发现，环孢素组和环孢素+康脉胶囊组具有抑制 PCNA蛋白表达、抑制 CDK2蛋白表达、抑制VEGF蛋白表达、增加VSMC的p21Cip1蛋白表达的趋势。

表3 各实验组家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响(±s)

表3 各实验组家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响(±s)

组别PCNA VEGF CDK2 p21Cip1裸支架组 4 0.0906 ±0.0066 0.0432 ±0.0179 0.0690 ±0.0019 n 0.0198 ±0.0034环孢素 A 组 4 0.0319 ±0.0066 0.0100 ±0.0024 0.0318 ±0.0068 0.0868 ±0.0075康脉胶囊组 4 0.1020 ±0.0210 0.0340 ±0.0099 0.0609 ±0.0074 0.0343 ±0.0124环孢素 A+康脉胶囊组 4 0.0306 ±0.1985 0.0100 ±0.0017 0.0305 ±0.00730.0818 ±0.0054

表4 各对比组间家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达P值比较

3 讨论

血管内支架植入术后再狭窄的机制十分复杂，是一个多因素共同作用的过程，目前为止研究者们提出了不少学说，包括早期的血管弹性回缩、血小板聚集和附壁血栓形成、损伤血管局部炎症细胞(T淋巴细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞)浸润、新生内膜增殖和细胞外基质形成、血管壁的重塑等，但真正确切的因果关系还需进一步研究。有研究称，冠状动脉植入金属裸支架后口服雷帕霉素组与对照组血管造影比较再狭窄率下降，管腔直径缩小程度减轻。由此可见，虽然免疫抑制剂预防ISR的机制还不十分明了，但可以认为免疫抑制剂的应用在预防血管内支架再狭窄是有效的。本实验从家兔血管内支架植入家兔髂动脉狭窄血管造影定量分析、血管内支架植入家兔髂动脉28天后扫描电镜比较、家兔血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1 蛋白表达影响等方面研究证明，免疫抑制剂环孢素及中药康脉胶囊在预防家兔髂动脉血管内支架早期再狭窄方面的有效性，由于本研究是小样本研究，更明确的结论还需要大量的实验研究观察和更多实验数据的支持，免疫抑制剂环孢素及中药康脉胶囊在预防血管内支架早期再狭窄方面的有效性有待于更进一步的研究。

［1］ 陆东风，刘威，李昭骥.雷公藤内酯醇对大鼠血管平滑肌细胞的增殖及DNA合成的影响［J］.岭南心血管杂志，2002，8(6):418－420