黄连素降糖调脂机制的研究

张 茜，肖新华，王 彤，朱席琳，李文慧，刘 英，袁 涛，孙晓方，孙 琦，向红丁，王 姮

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科，北京 100730;2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京 100730)

黄连素降糖调脂机制的研究

张 茜1，肖新华1，王 彤1，朱席琳2，李文慧1，刘 英2，袁 涛1，孙晓方1，孙 琦1，向红丁1，王 姮1

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科，北京 100730;2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京 100730)

目的 旨在研究黄连素对KKAy小鼠体重、血糖、血脂、胰岛素等相关代谢指标的影响，且应用基因芯片探讨黄连素降血糖、调血脂的机制。方法 选用KKAy小鼠16只，随机分为黄连素组(给予每日250 mg/kg的黄连素粉末悬浊液)和对照组(给予等体积生理盐水)，均连续灌胃4周。每周末测定小鼠空腹血糖(FBG)和体重。3周末进行口服糖耐量(OGTT)实验。4周末测定小鼠FBG、血脂和空腹胰岛素(FINS)水平。取小鼠骨骼肌组织进行RT-PCR基因芯片实验。结果 黄连素组小鼠FBG、OGTT曲线下面积(AUC)、TC、TG、FINS和HOMA-IR值均比对照组显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。基因芯片显示黄连素组 GLUT4、MAPK8、MAPK14、PPARα、UCP2上调，PPARγ、PGC、CEBP、resistin、HNF4α下调。结论 黄连素不仅能有效降低 KKAy小鼠 FBG，改善胰岛素敏感性，还能调节脂代谢。黄连素可能是通过AMPK-p38 MAPK-GLUT4通路调节KKAy小鼠血糖。PPARα上调参与黄连素对KKAy小鼠血脂的调节。

黄连素;KKAy小鼠;基因芯片;糖尿病;脂代谢紊乱;糖代谢

早在唐代名医孙思邈所著的《千金要方》中就有黄连配伍生地治疗消渴症的记载。2008年，Yin等［1］发现黄连素能降低新发2型糖尿病患者的糖化血红蛋白、空腹血糖、餐后血糖和甘油三酯。很多研究结果表明，黄连素对血糖、血脂的调节作用可能是多靶点的。有关机制的研究，体内实验方面寥寥无几。KKAy小鼠为自发性2型糖尿病模型，其在5周龄时出现肥胖、脂代谢紊乱和高胰岛素血症等代谢异常综合征，其发病是在遗传易感的基础上外加环境因素而诱发的，与人类2型糖尿病表现极为相似。基因芯片技术作为一种先进的高通量检测技术，具有灵敏、准确、高信息量等优点，可以对个体生物的大量基因表达信息进行高速、并行采集和分析。本研究旨在观察黄连素对KKAy小鼠体重、血糖、血脂和胰岛素的影响，并且使用基因芯片技术来探讨黄连素降血糖，调血脂的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

雄性 KKAy小鼠，体质量(30.02±1.83)g，购自中国医学科学院动物医学实验动物研究所【SCXK(京)-2008-0011】，喂以特殊的高脂饲料(每克饲料含58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白质，由中国医学科学院动物所提供)。小鼠适应72 h后，测随机血糖均高于11.1 mmo1/L。将 KKAy小鼠随机分为黄连素治疗组(给予每日250 mg/kg黄连素粉末悬浊液)和生理盐水对照组(给予等体积生理盐水)，每组8只。每天灌胃一次，每次每只灌胃0.3 mL，持续4周。黄连素粉末溶于生理盐水中配成25 g/L悬浊液。

1.2 相关指标测定

于开始灌胃当天，喂药后 7、14、21、28 d测量KKAy小鼠体重、FBG(禁食4 h尾部取血，葡萄糖氧化酶法)。灌胃后第21天行 OGTT实验，即 KKAy小鼠禁食 4 h后，灌胃葡萄糖溶液［2.2 g/(kg·bw)］，测定 0、30、60、120 min 各时间点的血糖值，计算AUC，AUC=0.5 ×(0 min血糖 +30 min血糖)/2+0.5×(30 min血糖 +60 min血糖)/2+1×(60 min血糖 +120 min血糖)/2。灌胃后第28天，禁食 4 h，处死，摘眼球取血，ELISA法测定FINS(Linco Corp)，计算 HOMA-IR，HOMA-IR =FBG(mmol/L)×FINS(μIU/mL)/22.5。酶法测定TC、TG、HDL-c和 LDL-c。

1.3 RT-PCR小鼠糖尿病基因芯片实验

1.3.1 肌肉组织总RNA抽提：处死小鼠后，立即取肌肉组织置液氮冻存备用。黄连素组和对照组各取3个样本。Trizol法提取 RNA。紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳对RNA含量和质量进行鉴定。

1.3.2 合成cDNA：总RNA逆转录得到单链cDNA。

1.3.3 实时定量PCR芯片：本研究应用小鼠糖尿病 PCR芯片(PAMM-023，SuperArray Bioscience Corp，Frederick，MD)，其包括90个糖尿病相关基因，涉及受体、转运、通路、核受体、代谢酶、分泌因子、信号转导以及转录因子等。将cDNA稀释后加入PCR芯片对应的每个孔中，将PCR芯片置于实时定量 PCR仪进行 PCR反应，设置程序如下：10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃ (40 个循环)，收集荧光信号。计算黄连素组和对照组中的每个通路相关基因的ΔCt值，相减得到每个基因的ΔΔCt值。通过2-ΔΔCt计算两组对应基因的表达差异。管家基因为hsp90ab1。Fold-change值的绝对值＞2，而且 P值＜0.05的基因为差异具有显著性。

1.4 统计学处理

定量指标均以¯x±s表示。组间比较采用Mann-Whitey U检验。采用SPSS12.0进行数据分析。基因芯片的数据用ΔCt法计算，用 PCR Array数据分析软件(Excel＆Web based)进行分析。

2 结果

2.1 黄连素对 KKAy小鼠体重、FBG、AUC、FINS、HOMA-IR和血脂的影响

在给予黄连素前(0周)对照组和黄连素组体重、FBG无显著差异。给予黄连素1至4周，黄连素组较对照组体重无显著差异，FBG持续显著下降(其中 1、2周 P ＜0.05，3、4周 P ＜0.01)(图 1)。OGTT结果显示黄连素组在葡萄糖灌胃前(0 min)以及灌胃后30、60、120 min各时点血糖值及 AUC均显著低于对照组(0 min和30 min P＜0.01，60 min、120 min和 AUC P ＜0.05)(图2，3)。给药4周后黄连素组FINS，HOMA-IR，TC和 TG较对照组显著降低(P＜0.05)，但 HDL-c和 LDL-c无显著变化(表1)，提示黄连素具有改善 KKAy小鼠胰岛素抵抗和脂代谢紊乱的作用。

图1 黄连素干预前后KKAy小鼠FBG比较Fig.1 Effect of berberine treatment on the body weight and FBG of KKAy mice

图2 黄连素干预3周后OGTT血糖结果比较Fig.2 Effect of berberine on OGTT blood glucose in KKAy mice at 3 weeks after berberine treatment

2.2 基因芯片结果

有关胰岛素通路的基因，黄连素组与对照组无显著差异，包括 AKT2、IKK2、IRS1、PIK3CD、PIK3R1和PTP1B。在糖代谢方面，黄连素组 GLUT4(foldchange=4.48)和 MAPK通路［包括 MAPK8(foldchange=13.15)和 MAPK14(fold-change=4.17)］基因上调。脂肪通路基因中黄连素组 PPARγ(foldchange=-5.51)、CEBP(fold-change=-3.06)和PGC(fold-change= -2.70)下调，PPARα(foldchange=2.10)上调。其他基因：黄连素组 UCP2(fold-change=2.55)和Hnf4a(fold-change=2.12)上调，resistin(fold-change=-2.12)下调(表 2，图4，彩插 3)。

图3 黄连素干预3周后OGTT血糖曲线下面积(AUC)结果比较Fig.3 Effect of berberine on AUC of OGTT blood glucose in KKAy mice

3 讨论

研究发现黄连素能显著降低KKAy小鼠FBG、AUC、FINS和 HOMA-IR值。揭示黄连素能降低KKAy小鼠血糖，改善糖耐量和胰岛素敏感性。这与之前黄连素在其他2型糖尿病大鼠模型中观察到的疗效是一致的［2，3］。本研究还发现黄连素能显著降低KKAy小鼠的总胆固醇和甘油三酯。揭示黄连素能调节KKAy小鼠的血脂。以往研究发现黄连素能降低糖尿病大鼠TG和 TC［4，5］。但是本实验未观察到黄连素降低LDL-C的作用。有研究给予32名血脂异常的患者黄连素观察到其能降低LDL-C水平［5］。

胰岛素信号通路是在胰岛素刺激下，葡萄糖摄取到骨骼肌和脂肪的途经［8］。本研究发现有关胰岛素通路的基因，黄连素组与对照组无显著差异。揭示胰岛素信号通路可能并不是黄连素降糖的主要机制。以往 的 研 究 也 支 持 这 一 观 点［6-8，10］。AMPK(AMP激活的蛋白激酶)是非胰岛素依赖性的调节葡萄糖转运的因子［9］。Xi等［11］发现 AMPK 能使p38 MAPK上调。在骨骼肌细胞，p38 MAPK参与GLUT4的激活［10］。本研究中发现黄连素组 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路和 GLUT4是上调的。推测黄连素是通过 AMPK-p38 MAPK-GLUT4通路来改善葡萄糖摄取的。Cheng等［7］发现黄连素在L6细胞是通过AMPK-p38 MAPK通路来诱导葡萄糖摄取的。但是 Zhou等［6］发现黄连素能增加AMPK磷酸化，但不激活 p38。有研究发现黄连素能刺激GLUT4的位移［2］。但是另外两组研究未观察到此结果［6，8］。

表1 黄连素干预4周后FINS、HOMA-IR和血脂比较(s，n=8)Tab.1Effects of berberine on FINS，HOMA-IR and lipid metabolic parameters in the KKAy mice(s，n=8)

表1 黄连素干预4周后FINS、HOMA-IR和血脂比较(s，n=8)Tab.1Effects of berberine on FINS，HOMA-IR and lipid metabolic parameters in the KKAy mice(s，n=8)

注：与对照组比较，*P＜0.05。Note： Compared with the control group，*P ＜0.05.

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表2 基因芯片结果Tab.2 The results of RT PCR gene array analysis

本研究发现黄连素组 PPARγ、PParγ共刺激因子 1α(PGC-1)、CCTTA/增强子结合蛋白(C/EBP)下调。几项研究都发现在脂肪组织，黄连素能下调促进脂肪合成的基因——PPARγ、C/EBP、PGC-1，促进前脂肪细胞的增殖，减少脂质堆积，抑制脂肪细胞的终末分化［2］。本研究揭示下调 PPARγ可能是黄连素能轻微降低体重的机制。

本研究发现黄连素能上调 PPARα水平。PPARα与血脂代谢关系密切，在多个水平参与血脂的调节［12］，如促进脂肪酸氧化和胆固醇逆向转运，降低血 TG和TC。PPARα上调可能是黄连素调节血脂的机制之一。另外本研究发现黄连素组MAPK8(JNK)是上调的。Lee 等［13，14］发现黄连素能通过JNK途经增加LDLR启动子的转录活性，增加LDLR mRNA的表达量，从而降低LDL水平。上调MAPK8可能是黄连素调节血脂的机制之一。

本研究发现黄连素组UCP2(解偶联蛋白2)上调。UCP2 能促进能量消耗［15］。Lee 等［2］发现在骨骼肌组织，黄连素能上调 UCP2。另外黄连素组 resistin(抵抗素)下调。Resistin能减少 AMPK磷酸化。丁来标等［16］发现黄连素能降低血清抵抗素，从而改善胰岛素敏感性。而且黄连素组HNF-4α是上调的。HNF-4α(肝脏核因子4α)可抑制糖异生，促进葡萄糖摄取，促进糖酵解。有研究显示小檗碱可增强IR大鼠肝脏HNF-4α mRNA及蛋白表达，改善胰岛素抵抗大鼠的高胰岛素血症，胰岛素抵抗指数明显降低［17］。

总之，本研究观察到黄连素能有效降低 KKAy小鼠血糖，改善胰岛素敏感性，降低胆固醇和甘油三酯。黄连素对KKAy小鼠血糖和血脂的调节机制是多通路的。本研究尝试使用具有研究针对性的功能分类基因芯片来探讨这些复杂的机制。并且，本研究选用黄连素治疗后的KKAy小鼠的骨骼肌作为实验材料，为黄连素降糖降脂的机制研究提供了体内实验的数据。当然，这些结果还需要进一步证实。

(本文图4见彩插3。)

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Mechanism of berberine regulating glucose and lipid metabolism studied with RT PCR array

ZHANG Qian1，XIAO Xin-hua1，WANG Tong1，ZHU Xi-lin2，LI Wen-hui1，LIU Ying2，YUAN Tao1，SUN Xiao-fang1，SUN Qi1，XIANG Hong-ding1，WANG Heng1
(1.Department of Endocrinology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China;2.National Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences;School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100730)

Objective To explore the effects of berberine on the weight，blood glucose，lipid metabolism and serum insulin in KKAy mice and to investigate its possible glucose-lowing and lipid-regulating mechanism.Methods KKAy mice were randomly divided into two groups： berberine group(treated with 250 mg/kg/d berberine，n=8)and control group(n=8).The fasting blood glucose，weight，TC，TG，HDL-c，LDL-c and fasting serum insulin were tested.The OGTT test was done.RT PCR array experiment was done using skeletal muscle of KKAy mice.Results Berberine significantly decreased fasting blood glucose，AUC，fasting serum insulin，HOMA-IR index，TC and TG，compared with those of the control group(P＜0.05 or P＜0.01).RT PCR array analysis showed that berberine up-regulated the expression of GLUT4，MAPK8，MAPK14，PPARα，UCP2 and HNF4α，while the expression of PPARγ，CEBP，PGC and resistin weredown-regulated(P＜0.05).Conclusions Berberine acts a function of regulating the levels of fasting blood glucose and lipid metabolism，and moderating insulin resistance in KKAy mice.The glucose-lowing mechanisms may be correlated with p38-MAPK-GLUT4 pathway.PPARα may be involved in the lipid-regulating mechanism.

Berberine;KKAy mice;RT PCR array;Diabetes mellitus;Lipid metabolic disorders;Glucose metabolism

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0029-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.007

北京协和医院基金项目(编号：2006119)。

张茜(1979-)，女，实习研究员，硕士，从事糖尿病研究工作。

肖新华(1962-)，男，主任医师，博士生导师，从事糖尿病研究工作。E-mail：xiaoxinhua@medmail.com.cn

2010-10-11