趋化因子CXCL10在心肌细胞及巨噬细胞中的表达机制

李子南，翟 原，卢 静，王 钜

(1.首都医科大学实验动物科学部，北京 100069;2.加州大学洛杉矶分校医学院外科学系器官移植中心，洛杉矶 CA91320)

趋化因子CXCL10在心肌细胞及巨噬细胞中的表达机制

李子南1，翟 原2，卢 静1，王 钜1

(1.首都医科大学实验动物科学部，北京 100069;2.加州大学洛杉矶分校医学院外科学系器官移植中心，洛杉矶 CA91320)

目的 探讨心肌缺血-再灌注损伤中趋化因子CXCL10的产生机制。方法 分别用LPS、H2O2、Ca2+载体A23187刺激原代培养的心肌细胞、骨髓来源的巨噬细胞或二者混合培养的共培养系统后，ELISA检测培养基上清中的趋化因子 CXCL10和促炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，观察其表达动力学。结果 ①大剂量(10 μg/mL)的LPS刺激心肌细胞主要产生趋化因子CXCL10;刺激骨髓来源巨噬细胞主要产生促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α。②H2O2、Ca2+通道激活剂并不能使产生趋化因子 CXCL10 或 IL-1β、IL-6、TNF-α 这些促炎性细胞因子。③骨髓来源的巨噬细胞促进心肌细胞表达趋化因子CXCL10;心肌细胞促进骨髓来源的巨噬细胞表达IL-6、TNF-α，但抑制IL-1β的表达。结论 心肌细胞是心肌缺血-再灌注损伤中CXCL10潜在的细胞来源;CXCL10的表达，主要依赖于TLR4的激活。

CXCL10;TLR4;心肌细胞;T细胞;缺血-再灌注损伤

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：心肌细胞原代培养采用Wistar大鼠，8周龄，雄性;骨髓来源巨噬细胞(bone marrowderived macrophages，BMMs)原代培养采用 Wistar大鼠，1日龄，雌雄不限。所有实验动物均来源于首都医科大学实验动物科学部［SCXK(京)2005-0006］。

1.1.2 仪器：CO2培养箱(美国 MMM公司)，荧光倒置显微镜(重庆 COIC公司)，离心机(美国 Sigma公司)。

1.1.3 主要试剂：DMEM高糖培养基、双抗、L-谷氨酰胺均为美国HyClone公司产品，特级胎牛血清为德国 Biochrom AG公司产品，BrdU、多粘菌素 B、HEPES为德国 Merck公司产品，胶原酶Ⅱ为美国Worthington公司产品，胰蛋白酶为美国 Amresco公司产品，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、钙离子载体(calcium ionophore)A23187为美国Sigma公司产品，H2O2为北京现代东方精细化学品有限公司产品，Rat CXCL10检测试剂盒为武汉优尔生科技股份有限公司产品，Rat IL-1β、IL-6、TNF-α 检测试剂盒为北京四正柏生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：①心肌细胞原代培养：75%乙醇消毒新生大鼠体表，开胸取出心脏，在无菌PBS中洗去血液，并剪成1 mm3的小块，随后将这些组织块移入50 mL离心管中，加入8 mL心肌组织消化液(0.05% 胰酶，0.05% 胶原酶 II，0.5%BSA)，放在恒温摇床上37℃摇5min消化组织。将离心管取下后自然沉淀后吸取上清，沉淀的组织块中继续加入新鲜的组织消化液。重复上述消化步骤数次直至大部分组织块被消化完。除第一次外，其余次消化得到的上清立即加入等体积的心肌细胞培养基(含10%血清、1%双抗、2 mol/L L-谷氨酰胺、0.01 mol/L BrdU、50 mg/L多粘菌素 B的 DMEM)中和消化，并1000 r/min离心6 min，获得的沉淀大部分为心肌细胞。用培养基重悬细胞，过200目细胞筛，并接种在培养皿中培养90 min使非心肌细胞贴壁，而后收集上清中未贴壁的心肌细胞，以2×106个/皿的密度接种于6孔细胞培养板中，5%CO2、37℃培养48h，换液，进行下步实验。LPS组的培养基中不加入多粘菌素B。②L929条件培养基的制备：以5×105个/瓶的密度将L929系细胞接种于75cm2细胞培养瓶中，并补充 L929培养基(含10%特级胎牛血清、1% 双抗、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM)至50 mL。5%CO2、37℃培养7d后收集培养基上清，过0.45 μm滤器，滤液便为 L929条件培养基(L929-conditioned medium)。③骨髓来源巨噬细胞原代培养：脱颈处死动物，75%消毒体表，取出两侧完整股骨，放入盛有酒精的无菌培养皿中浸泡。之后剪断股骨，暴露骨髓腔，用5mL注射器吸取BMM培养基(含20%L929条件培养基、10%血清、1%双抗、1%多粘菌素 B的 DMEM)，将骨髓腔中的骨髓冲出，获得其中的造血干细胞。收集洗液，充分吹打后以5×106个/皿的密度接种于100 mm培养皿中，在5%CO2、37℃下培养7 d，并每3 d更换一次培养基。第8天时将分化成熟的BMM消化下来，以5×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中。24h后换液，进行下步实验。LPS组的培养基中不加入多粘菌素B。④共培养系统建立：两种细胞原代培养方法同上。获得成熟的 BMM后，将其消化下来，与新制备的心肌细胞悬液混合，最终以1×106心肌细胞混合5×105BMM/孔的密度，接种于6孔细胞培养板中。培养基使用心肌细胞培养基，LPS组的培养基中不加入多粘菌素B。

1.2.2 实验分组：按不同药品(PBS、低剂量LPS、高剂量 LPS、H2O2、钙离子载体 A23187)刺激三种细胞(心肌细胞、BMMs、共培养系统)后三个时间点(6 h、12 h、24 h)，分为 39 组(BMM、共培养系统均不做1 μg/mL LPS 组)，每组 3 皿细胞。

1.2.3 药品剂量：H2O2是一种典型的氧自由基，常用于模拟由各种自由基造成的应激状态或损伤;而钙离子载体A23187是一种常用的钙离子通道激活剂，可使培养基中包含 Ca2+通过钙通道进入细胞内，造成细胞内钙超载。为了模拟再灌注损伤过程中的氧化应激以及钙超载，H2O2和离子载体A23187的应用浓度应使细胞处于一种应激状态，而不应该引起明显的细胞死亡。通过查阅文献以及预实验结果，二者浓度均选取为 0.02 μmol/L［4，10］。低剂量 LPS组采用 1 μg/mL，高剂量 LPS组采用10 μg/mL。上述浓度均为在培养基中的终浓度。

1.2.4 ELISA：①分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100 L不同浓度的标准品。空白孔加100 μL标准品/样品稀释液，其余孔加细胞培养上清100 mL，酶标板加上覆膜，37℃温育2。②弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素化二抗(临用前配制)100 mL，酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。③弃去孔内液体，每孔用400 μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2 min，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。④每孔加酶结合物(临用前配制)100 μL，加上覆膜，37℃ 温育 30 min。⑤弃去孔内液体，甩干，洗板5次。⑥每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在15～25 min，不要超过30 min。当标准孔的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔梯度不明显时，即可终止)。⑦每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(A值)。⑧各标准品及样本值扣除空白孔值后作图(七点图)。以标准品的浓度为纵坐标，A值为横坐标，绘出标准曲线，计算出回归方程。将样品的 A值代入方程式，计算出样品浓度。

2 结果

2.1 TLR4通路介导趋化因子CXCL10的表达

用不同剂量 LPS刺激心肌细胞，并对CXCL10的表达进行动力学监测。如图1所示，随着刺激时间的增加，心肌细胞CXCL10的表达量不断增加，在10 μg/mL LPS组中，CXCL10的表达量从 6 h的216 pg/mL，上升到 24h的 828 pg/mL(P＜0.01)。此外，心肌细胞CXCL10的表达呈现出明显的剂量反应，在24h时，低剂量组(1 μg/mL)CXCL10表达量为213 pg/mL，高剂量组(10 μg/mL)的表达量为828 pg/mL，是低剂量组的4倍(P＜0.01)。

用10 μg/mL的LPS(此剂量可明显的使心肌表达CXCL10)刺激BMM，并检测其CXCL10的表达从6h到24h一直保持在低水平(150 pg/mL到200 pg/mL之间)。

用10 μg/mL LPS刺激共培养系统，检测在6、12、24 h时趋化因子CXCL10的表达量，均比心肌细胞高。虽然这种差异没有统计学意义，但是值得注意的是，在共培养系统中，心肌细胞的数量只是单纯培养心肌细胞的一半(106个/孔)，但却产生相同甚至更多的CXCL10。

2.2 氧化应激、钙离子超载对CXCL10表达的影响

用H2O2刺激细胞模拟氧化应激，或用钙离子载体A23187刺激细胞模拟钙离子超载，对于心肌细胞不能刺激其产生CXCL10(所有时间组表达量均未超过50 pg/mL)。但是二者可以刺激巨噬细胞产生CXCL10，在12 h组最为明显，其表达量分别是对照组(PBS组)的4倍(P＜0.05)和6倍(P＜0.05)。

图1 用LPS刺激细胞后，培养上清中CXCL10含量(s，pg/mL)Fig.1 CXCL10 concentrations in the medium at 6 h，12 h and 24 h after LPS stimulation(s，pg/mL)

图2 用H2O2或钙离子载体A23187刺激细胞后，不同时间培养上清中CXCL10含量(s，pg/mL)Fig.2 CXCL10 concentration in the medium at 6 h，12 h and 24 h after H2O2or calcium ionophore A23187 stimulation(s，pg/mL)

2.3 TLR4 通路介导 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子的表达

与CXCL10相比，LPS并不能明显的刺激心肌使其产生 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子，只有在24 h组中IL-6这个指标与对照组(PBS组)有统计学差异。

对于BMM，虽然大剂量的LPS不能刺激其产生趋化因子CXCL10，但是却可以产生其他促炎性的细胞因子，IL-1β(12 h组和 24 h组)、IL-6(6 h组)、TNF-α(12 h组)均与其对照组(PBS组)有统计学差异。

图3 用LPS刺激细胞后，不同时间培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(s，pg/mL)Fig.3Concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the medium at 6 h，12 h and 24 h after LPS stimulation(s，pg/mL)

从共培养系统组可以看出，对于LPS诱导的IL-6、TNF-α表达，心肌细胞与 BMM表现出协同作用。对于 IL-6 和 TNF-α，在 6、12、24 h 时共培养系统的表达量均高于心肌细胞和巨噬细胞单独培养(P＜0.05)。而对于IL-1β这个指标来说，共培养系统组却要低于单独培养的BMMs组(P＜0.05)。

2.4 氧化应激、钙离子超载对促炎性细胞因子表达的影响

图 4 显示，对于 IL-1β、IL-6、TNF-α 这三个指标，心肌细胞、巨噬细胞或共培养系统的H2O2组及钙离子载体 A23187组均与对照组(PBS组)无统计学差异。

3 讨论

课题组前研究已证实，在发生缺血-再灌注损伤的心肌组织中有趋化因子 CXCL10 的表达［7，8］;但是，心肌组织是由心肌细胞(实质细胞)、固有的巨噬细胞(间质细胞)等多种细胞成分组成，所以CXCL10的细胞学来源并不确定。本次实验利用细胞培养的方法发现，与肝脏不同［13］，心肌细胞作为心肌组织中的实质细胞可以表达趋化因子 CXCL10，但这种表达需要大剂量的LPS刺激才可以产生。

在细胞实验中，LPS可以特异性的激活 TLR4通路;而在动物实验中，当再灌注发生时，受损的组织所释放内源性配体(如热休克蛋白、高迁移率族蛋白1等)可激活TLR4［11］，介导多种促炎性的细胞因子、趋化因子的表达。除TLR4被激活外，再灌时恢复氧气供给的心肌组织中会有大量的氧自由基产生，造成细胞的氧化应激甚至损伤，引起心肌细胞一系列基因表达的改变［9］;并且，缺氧造成的能量代谢障碍也会引起细胞内外离子交换紊乱，Ca2+在细胞内聚集，即“钙超载”(Ca2+overload)，Ca2+作为一种重要的第二信使，其在细胞内的累积势必影响相关信号通路下游的基因表达改变。

综上所述，除 TLR4通路外，氧化应激、钙离子超载也可能引起趋化因子CXCL10的表达，故在本次实验中设置了H2O2组以及钙离子载体 A23187组。本次实验结果显示，H2O2诱导的氧化应激、钙离子载体A23187诱导的钙离子超载，二者均不能刺激心肌表达任何的趋化因子或细胞因子。这说明，当心肌发生再灌注损伤时，CXCL10以及其他促炎性因子的产生主要是由TLR4通路介导的。

TLR4主要在单核/巨噬细胞的细胞膜上表达，有报道称在心肌细胞上同样有 TLR4的表达［15］。本次研究发现，大剂量(10 μg/mL)的LPS可以激活心肌细胞上的TLR4，而且主要引起CXC10的表达，而不是表达IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子，提示在大剂量LPS诱导心肌细胞TLR4激活后，选择性激活其下游的MyD88非依赖性通路产生CXCL10。相反，10 μg/mL LPS不能使 BMM 产生 CXCL10，但是却能使其表达 IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎性细胞因子，提示BMM上的TLR4被大剂量LPS激活后，主要通过 MyD88依赖性通路表达 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子。

近期，已有国外研究小组报道，微量(10 ng/mL)的LPS就可以刺激BMM产生CXCL10以及IL-6、TNF-α［13］;但本研究小组研究发现，大剂量 (10 μg/mL)的 LPS刺激 BMM后，却未观察到明显的CXCL10表达的上调，提示 BMM，LPS诱导的 TLR4下游通路的选择与剂量有关，即微量 LPS刺激时MyD88依赖性及非依赖性通路都被激活，而高剂量LPS抑制MyD88非依赖性通路，而不影响MyD88依赖性通路。

共培养系统对大剂量LPS的反应性结果表明，心肌细胞、巨噬细胞在对趋化因子CXCL10以及促炎性细胞因子 IL-6、TNF-α的表达中表现出协同作用;在IL-1β的表达中表现出拮抗作用。二者之间的这种协同或抑制作用可能是由别的分子(如IFN-β)或通路(如JAK-STAT通路)介导，其机制还需要进一步研究证明。

图4 用H2O2或钙离子载体A23187刺激细胞后，不同时间培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量(s，pg/mL)Fig.4 Concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the medium at 6 h，12 h，24 h after H2O2or calcium ionophore A23187 stimulation(，pg/mL)

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Mechanism of CXCL10 expression in cardiac myocytes and bone marrow-derived macrophages

LI Zi-nan1，ZHAI Yuan2，LU Jing1，WANG Ju1
(1.Department of Laboratory Animal Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China;2.Dumont-UCLA Transplantation Center，Department of Surgery，UCLA School of Medicine，Los Angeles，CA 91320，USA)

Objective To investigate the mechanism of CXCL10 expression during myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods To stimulate cardiac myocytes，bone marrow-derived macrophages(BMMs)and co-culture system with LPS，H2O2or calcium ionophore A23187 respectively，and then test the CXCL10，IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the supernant of medium by ELISA.Results ①High dose(10 μg/mL)LPS could induce cardiac myocytes to express CXCL10 as well as BMMs to produce IL-1β，IL-6，TNF-α. ②H2O2，calcium ionophore A23187 failed to induce CXCL10 expression or IL-1β，IL-6，TNF-α expression，either on cardiac myocytes or on BMMs. ③BMMs promote CXCL10 induction of cardiac myocytes，while cardiac myocytes promote IL-6 and TNF-α induction of BMMs.Oppositely，the IL-1β induction of BMMs was inhibited by cardiac myocytes in this research.Conclusion Cardiac myocytes could be the potential cellular resource during myocardial ischemia-reperfusion injury.It is mainly the activation of TLR4 that cause CXCL10 expression.

Ischemia-reperfusion injury;Cardiac myocyte;TLR4;T cell;CXCL10

CXCL10;TLR4

A

1005-4847(2011)01-0059-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.014

CXCL10属于趋化因子中CXC亚家族，可趋化多种炎性细胞，包括T淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤(NK)细胞等进入炎症部位，从而介导Th1型炎症反应性疾病［1-3］。在本课题组之前的研究中已证明，发生再灌注损伤的心肌组织中有CD4+T细胞的浸润，这种浸润伴随着T细胞特异性的趋化因子CXCL10 表 达 上 调［7，8］。本 次 研 究 主 要 探 讨：①TLR4通路是否参与了CXCL10的表达?②CXCL10产生的细胞学机制。

李子南(1985-)，男，硕士研究生。研究方向：再灌注损伤的免疫损伤机制。

王钜，教授。E-mail：wangju@ccmu.edu.cn

2010-11-08