心率变异性评估运输应激对Beagle犬自主神经功能的影响

潘永明，何 欢，陈 亮，徐孝平，杨玉伟，朱科燕，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

心率变异性评估运输应激对Beagle犬自主神经功能的影响

潘永明，何 欢，陈 亮，徐孝平，杨玉伟，朱科燕，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

目的 基于心率变异性(heart rate variability，HRV)分析评估运输应激对 Beagle犬自主神经功能的影响，并界定其恢复期。方法 16只Beagle犬随机分成两组(每组8只)，即对照组和运输应激组，利用大动物无创生理信号遥测技术，分别监测清醒自由活动状态下对照组和运输应激组应激4 h后、恢复1、2、3周时，Beagle犬的心电图(ECG)的改变情况，并用HRV分析评估其自主神经功能情况。结果 ①Beagle犬HRV参数具有明显的昼夜节律变化(P＜0.01)，与对照组比，运输应激后Beagle犬的HRV时域分析参数中RR间期、SDNN、RMSSD、TI、pNN50、STV和LTV参数均出现明显的降低 (P＜0.05，P＜0.01)，且恢复3周后时域分析参数恢复至正常水平;②与对照组比，运输应激后Beagle犬频域分析参数中HR、LFnorm、LF/HF比值均显著升高(P＜0.01)，而 LnTP、LnVLF、HFnorm均出现明显的降低(P＜0.01)，且恢复3周后频域分析参数恢复正常水平;③运输应激后，Beagle犬HR与HRV参数具有显著的相关性(P＜0.01)。结论 运输应激可引起Beagle犬交感神经活动增强，使得交感神经/副交感神经活动平衡发生紊乱，导致HRV降低，其可能是引起Beagle犬自主神经功能紊乱的主要原因之一。Beagle犬运输应激后，最好进行2周以上或3周的恢复期。

运输应激;心率变异性;自主神经功能;无创遥测;Beagle犬

良好的实验动物福利和健康状态，首先从评估和改善饲养和管理系统是最基本的也是尤为重要的一环，可从来源上控制和降低动物的应激因素。虽然运输是不可避免的应激因素之一，但如何有效评估动物运输后的状态对后续的实验研究就显得尤为重要。尽管目前评估动物的应激反应，除了动物的行为观察外，更多的主要测定应激反应因子、血液生化、生物学参数和心率的测定等［1-3］，且目前对动物心率的检测很常规化，但往往需要固定、麻醉等操作，有时由于动物不配合或实验操作不当，加剧应激因素的递增，使得检测结果准确性降低，因此，本研究利用最新的大动物无创遥测技术，排除了手术、麻醉、固定等人为因素的干扰，在清醒、自由的状态下遥测动物的心电图，提高结果的准确性。近几年来，大量研究表明心率变异性(heart rate variability，HRV)是评估心脏自主神经功能的定量性和独立评价指标，也是一种更方便、直观、无创性的研究手段，目前已在冠心病、糖尿病、高血压、红斑狼疮、情绪应激、肠易激综合征等临床疾病诊断中显示出较高的临床应用价值，但目前基于HRV方法评估实验动物应激状态的报道较少。因此，本文利用大动物无创生理信号遥测系统并采用HRV分析法评估运输应激后Beagle犬的精神状态，并界定运输应激后Beagle犬的恢复期，为评估实验动物精神健康提供有效的评价指标和参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级 beagle犬16只，体质量8.0～9.0 kg，雌雄各半，由南京安立默科技有限公司提供［SCXK(苏)2005-0003］，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［SYXK(浙)2008-0116］，环境温度为(22±2)℃，相对湿度为40% ～65%。饲喂普通营养颗粒饲料和自由饮水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 仪器设备

EMKA大动物无创生理信号遥测系统，法国EMKA公司生产。

1.3 分组及处理

按体重将 beagle犬随机分成两组：即对照组(control group，control)和运输应激组(transportation stress group，TS)，每组8只。①对照组：不经历运输应激处理;②运输应激组：空调面包车运输(70～80 km/h)模拟，室内温度控制在23℃ ～25℃左右，按同性别分装于运输笼中(运输笼尺寸为90 cm×50 cm×50 cm，每笼2只)，运输时间为4 h，途中不给予任何食物和饮水，应激处理4 h后，进行恢复性适应饲养3周。

1.4 心电遥测监测

按文献［4］贴上心电电极，建立无创心电遥测装置，并经EMKA Iox.2.0软件记录I、II导联心电图，放大倍数为500 Hz，连续监测24 h。其中对照组Beagle犬监测1次24 h心电图作为正常对照，运输应激组分别在运输应激后当天(R0WK)、恢复1周(R1WK)、2周(R2WK)、3周(R3WK)时监测 24 h心电图，白天时间为 8：00 ～20：00，晚上时间为 20：00 ～凌晨 8：00。

1.5 HRV参数分析

将心电图图形导入ECG-Auto V2.6.0.20软件进行自动化分析RR间期和心率变异性。时域分析指标以 SDNN(RR间期的标准差)、RMSSD(相邻RR间期差值平方和的均方根)、HRV三角指数(TI，NN间期的总个数除以 NN间期直方图的高度)、pNN50(相邻 R-R间期差值＞50 ms的窦性个数占心搏总数的百分比)、STV(短时程变异)、LTV(长时程变异)表示;按文献［5］采用 FFT功率谱分析，获取总功率(TP)、极低频功率(VLF)、低频功率(LF)和高频功率(HF)，进行 Ln化，同时对 LF和 HF进行标准化处理，计算LF/HF平衡指数。

1.6 统计学处理

数据以¯x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，相关性采用 Pearson r相关分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 运输应激对Beagle犬HRV时域分析参数的影响

Beagle犬的HRV时域分析参数具有明显的昼夜节律变化(P＜0.01);与对照组比，运输应激4 h后 Beagle 犬 RR 间期、SDNN、RMSSD、TI、pNN50、STV和LTV参数均出现明显的降低(P＜0.05，P＜0.01)，且以SDNN、STV、LTV变化明显;其中运输应激组 Beagle犬常规饲养恢复2周后，除 SDNN和LTV参数仍显著低于对照组外(P＜0.05)，其他参数均有所恢复，继续恢复至3周后，HRV时域分析参数基本恢复正常，与对照组比差异均无显著性(P＞0.05);另外，运输应激处理4 h后均未引起Beagle犬HRV时域分析参数昼夜节律的明显破坏，见图1。

图1 运输应激对beagle犬HRV时域分析参数的影响Fig.1 Effect of transportation stress on the parameters of HRV time domain analysis in beagle dogs

2.2 运输应激对Beagle犬HRV频域分析参数的影响

Beagle犬的HRV频域分析参数亦具有明显的昼夜节律变化(P＜0.01);与对照组比，运输应激4 h后Beagle犬 HR、LFnorm、LF/HF比值均显著升高(P ＜0.01)，而 LnTP、LnVLF、HFnorm 均出现明显的降低(P＜0.01)，以LFnorm和 LF/HF变化明显;其中运输应激组Beagle犬常规饲养恢复2周后HRV频域分析参数虽有所恢复，但仍与对照组比差异均有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，继续恢复至3周后，HRV频域分析参数基本恢复正常，与对照组比差异均无显著性(P＞0.05);另外，运输应激处理4 h后亦未引起Beagle犬HRV频域分析参数昼夜节律的明显紊乱，见图2和图3。

2.3 运输应激后Beagle犬HR与HRV参数的相关性分析

运输应激后Beagle犬HR与HRV时域和频域分析参数均具有显著的相关性(P＜0.01)，见表1。

3 讨论

应激(stress)是动物机体受到刺激时所引起的应答性反应，多种原因诸如运输、过热、缺乏营养、精神紧张等都可引发动物的应激。其中，运输是诸多应激原中较为重要的之一，因影响因素多，严重可导致动物发病、死亡或致残。Beagle犬在运输应激4 h后，表现出恐惧、高声吠嚎、精神紧张、伏卧疲乏等，且怕与人员亲近，但体重降低变化不明显，表明在适宜的运输环境条件下短期的运输应激对动物体格方面影响较少，也未引起动物自身昼夜节律变化的紊乱，继续恢复适应2～3周后，动物开始表现出活泼、精神等现象，且喜与人员亲近。

图2 运输应激对Beagle犬HRV频域分析参数的影响Fig.2 Effect of transportation stress on the parameters of HRV frequency domain analysis in the beagle dogs

图3 对照组和运输应激4 h后Beagle犬24 h HRV功率谱图Fig.3 Representative tachograms for beagle dog 24 h HRV of their respective power spectra in the control group and transportation stress 4 h group.

表1 运输应激后Beagle犬HR与HRV参数的相关性Tab.1 Correlation between HR and HRV parameters in beagle dogs after transportation stress

HRV是指逐次心搏间期之间的微小变异，具体表现为每个心动周期时间上的不规则变化，可反映心交感神经、迷走神经活动的紧张性、均衡性及其对心血管活动的影响［6］。心脏作为机体适应能力的标识，对不同内外影响作“回应”，且本项目组前期研究已表明运输应激能引起Beagle犬的心功能显著降低，舒缩功能发生紊乱［7］，因此，本研究采用HRV分析中的时域和频域分析法，两者相结合来评估beagle犬在运输应激后心脏自主神经功能总体情况及心脏交感神经、副交感神经各自活性及平衡的变化情况。

目前HRV分析中时域分析法主要以R-R间期的变异为基础，可用标准差、方差、极差、变异系数等来表达。其中SDNN是反映交感和迷走神经活性，与HRV三角指数一样均能反映总的HRV变化;RMSSD和pNN50是反映迷走神经活性和迷走神经张力的大小，与心率快速变化有关。STV可反映呼吸幅度的变化，LTV反映压力感受器和体温调节的影响［8］。本研究结果显示 Beagle犬在运输应激4h后，RR 间期、SDNN、RMSSD、TI、pNN50、STV 和 LTV参数均出现降低明显，且以 SDNN、RMSSD、STV和LTV变化最为明显，提示运输应激后可引起动物呼吸幅度减少、频率加快，同时由于压力感受器和体温调节出现紊乱，使得心交感神经活性相对明显增加，迷走神经活动减弱，导致HRV降低。

HRV分析中频域分析法则是把心率变化信号分解为不同的频率成分并将其相对强度定量为功率，提供了各种频率成分的功率谱测定，HF是反映迷走神经调节功能;LF反映交感神经的调节功能，也有报道其受交感神经和迷走神经的共同活动［9］;VLF有报道与外周血管舒缩及肾素-血管紧张素系统活动有关，但具有的生理意义有待于进一步的探讨［10］，TP是信号总的变异性，HRV的总和;LF/HF反映交感神经和迷走神经的均衡性。本研究结果发现，Beagle犬在运输应激4 h后，HR、LFnorm、LF/HF比值均显著升高，而 LnTP、LnVLF、HFnorm均明显降低，且以LFnorm和LF/HF比值变化较为明显，进一步证明运输应激可引起心率加快，心交感神经活动相对增强，导致交感神经/副交感神经活动平衡紊乱，使得总HRV降低，与HRV时域分析结果相一致;有文献表明应激影响免疫系统和内分泌系统［1］，本研究发现Beagle犬在运输应激后VLF明显降低，表明VLF的降低可能与激素、免疫、神经内分泌紊乱有关，具体还有待于进一步的研究。

本研究利用大动物无创生理信号遥测技术，监测清醒自由活动状态下beagle犬24 h的动态心电图，并可观察到明显的 HRV昼夜节律变化，白天以交感神经活动为主，晚上则以迷走神经活动为主，且在运输应激后HR与HRV时域和频域分析参数均具有显著的相关性，表明采用无创生理信号遥测技术，可大大减少人为因素误差，利用HRV方法评估动物的应激状态，可作为评价动物的精神恢复程度的重要指标。另外，结果还发现beagle犬在运输应激后，在适应性恢复2周时虽有大部分HRV参数明显恢复，但仍与对照组比差异明显，直至恢复到第3周后HRV参数均能达到正常状态，因此，建议beagle犬在运输应激后最好进行为期2周以上或3周的恢复期。

［1］ 杨斐，胡樱.短途运输应激对Wistar大鼠的影响［J］.中国实验动物学报，2009，17(4)：279-283.

［2］ 饶开晴，夏东，刘锐，等.大鼠模拟运输应激的效果分析［J］.西南民族大学学报·自然科学版，2007，33(6)：1321-1323.

［3］ Watts JM，Stookey JM.Effects of restraint and branding on rates and acoustic parameters of vocalization in beef cattle［J］.Appl Anim Behav Sci 1999，62：125-135.

［4］ Moyser K，Schofield J，Simpso D，et al.Benefits and limitations of an external telemetry system on canine toxicity studies［J］.Animal Technol Welfare，2004，4：51-52.

［5］ Harada T，ABE J，Shiotani M，et al.Effect of autonomic nervous function on QT interval in dogs［J］.J Toxicol Sci，2005，30(3)：229-237.

［6］ Lombardi F.Chaos theory，heart rate variability，and arrhythmic mortality［J］.Circulation，2000，101(1)：8-10.

［7］ 潘永明，陈方明，陈亮，等.长途运输致亚健康的Beagle犬心功能观测［J］.实验动物与比较医学，2007，27(2)：107-111.

［8］ van Ravenswaaij-Arts CMA，Kollee LAA，Hopman JCW，et al.Heart rate variability［J］.Ann Int Med，1993，118(6)：436-447.

［9］ Iwao T，Yonemochi H，Nakagawa，et al.Effect of constant and intermittent vagal stimulation on the heart rate and heart rate variability in rabbits［J］.Jap J Physiol，2000，50：33-39.

［10］ Martinmaki K，Rusko H，Saalasti S，et al.Ability of short-time Fourier transform method to detect transient changes in vagal effects on hearts： a pharmacological blocking study ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(6)：2582-2589.

Assessment of the effect of transportation stress on autonomic nervous function in beagle dogs based on heart rate variability(HRV)analysis

PAN Yong-ming，HE Huan，CHEN Liang，XU Xiao-ping，YANG Yu-wei，ZHU Ke-yan，CHEN Min-li
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center，Hangzhou 310053，China)

Objective To assess the effect of transportation stress on autonomic nervous function in beagle dogs based on heart rate variability(HRV)analysis，and define its recovery.Methods Sixteen beagle dogs were randomly divided into two groups(n=8 in each)：the control group and transportation stress group.Using a non-invasive telemetry system in conscious and unrestrained beagle dogs，electrocardiograms(ECG)were recorded in both groups after a 4 h transportation stress and after a recovery of 1，2 and 3 weeks.HRV analysis was used to assess the autonomic nervous function.Results (1)There was an obvious circadian rhythm in beagle dogs(P ＜0.01).Compared with the control group，the RR interval，root-mean-square of successive differences(RMSSD)，HRV triangular index(TI)，pNN50，short term variability(STV)and long term variability(LTV)parameters of their HRV time domain analysis were significantly lower than those of control group(P＜0.05，P＜0.01).The time domain analysis parameters recovered to normal levels at 3 weeks after recovery.(2)Compared with the control group，heart rate(HR)，normalized low frequency(LFnorm)and LF/HF in the transportation stress group were significantly higher than those of control group(P＜0.01)，while total power(TP)，very low frequency(VLF)and normalized high frequency(HFnorm)were lower than those of control group(P＜0.01)，which also took 3 weeks to recover.(3)There was a significant correlation between heart rate and time and frequency domain indices after transportation stress(P＜0.01).Conclusions Transportation stress can increase the sympathetic nervous activities，disturb the balance of sympathetic and parasympathetic nervous activities and lead to a decrease of HRV，which may be a major cause of autonomic nervous function disorder.It needs more than 2 or 3 weeks for beagle dogs to recover after the transportation stress.

Transportation stress;Heart rate variability;Autonomic nervous function;Non-invasive telemetry;Beagle dog

Q95-33，R-332

A

1005-4847(2011)01-0069-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.016

浙江省实验动物科技计划项目(2009F80018);浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目。

潘永明(1979-)，男，助理研究员，研究方向：实验动物与动物实验。E-mail：pym918@126.com

陈民利(1962-)，女，教授，研究方向：实验动物与比较医学。E-mail：minli-chen01@yahoo.com

2010-08-04