2-脱氧葡萄糖诱导大鼠内质网应激预处理模型的最佳剂量

张春雪，闵鹤鸣，闵连秋

(1.辽宁医学院附属第一医院神经内科，锦州 121001;2.辽宁医学院基础学院，锦州 121001)

2-脱氧葡萄糖诱导大鼠内质网应激预处理模型的最佳剂量

张春雪1，闵鹤鸣2，闵连秋1

(1.辽宁医学院附属第一医院神经内科，锦州 121001;2.辽宁医学院基础学院，锦州 121001)

目的 探讨2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-glucose，2-DG)诱导大鼠内质网应激模型的最佳剂量。方法 选择Wistar雄性大鼠108只，体质量240～260 g，采用不同剂量2-DG建立大鼠内质网应激的模型，随机分为6组：2-DG 50、100、150、200 mg/kg组，假手术组，缺血再灌注组。2-DG组按工作浓度为50 mg/mL溶于双蒸水腹腔注射7 d，假手术组和缺血再灌注组腹腔注射双蒸水7 d，于脑缺血再灌注后12 h处死，对各组大鼠进行神经行为学评分，采用HE染色观察脑组织的病理形态，免疫组化法和Westernblot法测定GRP78蛋白的表达，用PCR法检测GRP78 mRNA的表达。结果 与脑缺血再灌注组相比，2-DG各剂量组大鼠的神经行为学评分明显减低(P＜0.01)，而以100 mg/kg组评分减低最为明显(P＜0.05);2-DG各剂量组能不同程度的改善大鼠脑海马CA1区神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜趋于清楚、形态接近正常、核仁清晰可见的神经细胞数目增多，而以2-DG100 mg/kg组的效果最为明显。2-DG各剂量组GRP78蛋白表达明显增加，与脑缺血再灌注组比较，差异有显著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg剂量组的GRP78蛋白表达最高，与其他2-DG剂量组比较差异有显著性(P＜0.05)。结论 2-DG对脑缺血再灌注所致的神经细胞损伤具有保护作用，其最佳剂量为100 mg/kg。2-DG具有诱导大鼠内质网应激的作用，其最佳剂量是100 mg/kg。

2-脱氧葡萄糖;内质网应激;大鼠;模型，动物

内质网是人体新合成蛋白进行折叠、组装、翻译后修饰和 Ca2+储存的主要场所［1］，其生理功能易受内外环境的变化如缺血、缺氧、Ca2+耗竭、葡萄糖/营养缺乏、蛋白质转运异常、氧化应激等的影响，导致内质网功能紊乱及相关反应称为内质网 应 激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)［1，2］。凡是影响内质网功能的因素几乎都能引起ERS，如营养物质缺乏、干扰蛋白质翻译、影响内质网钙离子平衡、蛋白结构异常以及缺氧、病毒感染、抑制内质网和高尔基体之间囊泡转运的药物等。目前国内外对ERS的研究比较多，诱导ERS的药物也种类繁多，但是对其应用的最佳剂量尚未见报道。本实验试图确定2-DG诱导大鼠内质网应激预处理模型的最佳剂量。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

选择SD雄性大鼠108只，体质量240～260 g，来源于辽宁医学院实验动物中心【SCXK(辽)2003-0007】。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。每笼2只喂养，动物自由饮食，在基础学院2级动物实验室(室温22℃，湿度45%)喂养一周，适应环境后开始实验。药品：2-DG购于天津致远公司;GRP78一抗、二抗购于北京博奥森试剂公司;Trizol试剂，逆转录酶，Tag酶等PCR试剂购于大连宝生物。LEICA-RM-2135石蜡切片机：德国莱卡;CSIV型摊片烤片机：孝感市电子仪器厂;恒温水浴箱：湖北黄石仪器厂;BH/CH20BIMF200显微镜：日本奥林巴斯;CIAS-1000型图像分析仪：北京大恒图像视觉有限公司等。

1.2 分组与给药

108只大鼠随机分成6组，每组18只大鼠：假手术组、脑缺血再灌注(I/R)组、2-DG组4个剂量组(2-DG：50、100、150 和 200 mg/kg)。大鼠大脑中动脉缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的制备参照 Zea Longa［3］法并加以改进，用线栓阻断左侧MCA的血液供应。用10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，颈部正中切口，手术显微镜下，暴露左侧颈总动脉，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，结扎ECA的根部，用动脉夹夹闭ICA远端，在左侧 CCA分叉处的下方剪一小口，插入已知长度的碳素鱼线(线前端预先加热成光滑的椭圆形，直径为(0.18±0.20)mm，去除动脉夹，缓慢推进线栓约(18±2)mm，感到有轻微阻力时停止，扎紧结扎线并固定插线。缺血2 h后再灌注后12 h处死大鼠。2-DG的四个剂量组，分别按照 50、100、150、200 mg/kg的剂量进行腹腔注射，每天1次，连续7 d(将2-DG溶于双蒸水，工作浓度为50 mg/mL);I/R组和假手术组给予相同体积的双蒸水替代2-DG腹腔注射，每天1次，连续7 d。假手术组插入深度少于15 mm。模型成功的标志是术后动物出现同侧 Horner＇s征及动物麻醉清醒后出现以左前肢为主的偏瘫，评分在1～3分。

1.3 检测指标

1.3.1 神经行为学评分：参考经典的 Zea Longa［3］法对大鼠在 MCAO术后清醒后到12 h进行3次神经功能评分，取平均值。神经功能缺失评分标准为：0分：无神经功能缺损症状，活动正常。1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪。2分：中度局灶性神经功能缺损，爬行时出现向对侧转(追尾现象)。3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时身体向对侧倾斜。4分：不能自发行走，意识水平下降。

1.3.2 脑组织病理学观察：造模后再灌注12 h大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，打开颈部，暴露颈右总动脉，插管，先输注生理盐水约50 mL，然后输注4%多聚甲醛约50 mL，脱颈处死，取脑。甲醛固定，冠状脑片制备，选择梗死中心(即最大层面)，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行苏木素-伊红(HE)染色，分别观察梗死中心区、梗死周边区脑组织(海马CAl区、CA3区)，前述区域神经细胞和血管内皮细胞(每个观察区选择具有代表性标本观察结果并记录)。

1.3.3 大鼠海马CA1区葡萄糖调节蛋白(GRP78)表达的定性测定：造模后12 h，大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后固定，颈正中偏右切口，暴露右颈总动脉，用NS约50 mL灌注，然后用4℃4%多聚甲醛液约50 mL灌注固定，4 h脱颈处死，取脑，取双侧大脑冠状位距嗅球尖端6～11 mm的脑组织块，放入4%多聚甲醛固定液中继续固定24 h，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。从冠状面中1/3层面开始留取切片。厚度5 mm，连续切片，切片贴附于经APES处理的载玻片上，备用。用免疫组化法测定。严格按试剂盒说明书进行操作。观察大鼠海马CA1区，每张取5个视野数采用CIAS-1000型图像分析仪计算GRP78的阳性细胞数，取其平均值。

1.3.4 大鼠海马CA1区GRP78蛋白表达的定量测定：每组动物6只，用10%的水合氯醛按350 mg/kg剂量腹腔注射麻醉动物，脱颈取脑。剪碎脑组织置于裂解液中机械匀浆，4℃ 17 000 r/min离心1 h，取出上清液，弃去沉淀。用考马斯亮蓝G250结合法，根据已知牛血清白蛋白溶液的浓度及其吸光度和样品吸光度计算样品蛋白浓度和加样量。加入样品缓冲液，置于沸水浴中5 min使蛋白变性。制备7.5%分离胶和4%浓缩胶，用微量注射器将样品加在凝胶表面的样品槽中。电泳后转移至硝酸纤维素膜上。5%奶粉TTBS缓冲液振荡封闭3 h后洗膜，分别加入一抗 GRP78、β-actin，4℃冰箱孵育一夜。洗膜，辣根酶标记羊抗兔IgG HRP，室温孵育1 h，洗膜后进行ECL(enhanced chemiluminescence)反应1～3 min，暗室曝光Santa Cruz，显影后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像分析测定目标带的DV(integrated density value)，计算出各组目标带与 β-actin DV比值。

1.3.5 大鼠海马CA1区GRP78 mRNA表达的测定：总RNA的提取按Trizol试剂盒说明进行。按试剂盒说明进行反转录，扩增体系：10×Taq buffer 2 μL，25 mol/L Mgcl21 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Taq 酶 0.2 μL，超 纯 水12.8 μL。利用引物 5′-ATAATCAGCCCACCGTAA-3′和 5′-CCAATTCATTCCTCGTGT-3′扩 增 330 bp 的GRP78片段，利用引物 5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′和 5′-AGCCAGGGCAGTAATCTC-3′扩 增 630 bp的 β-actin。GRP78扩增条件：94℃ 5 min预变性，94℃ 变性 50 s，54℃复性 50 s，72℃ 延伸 50 s，30个循环，最后经72℃延长10 min终止反应。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分

各组大鼠的神经行为学评分分别为：假手术组：0.00±0.00，脑缺血再灌注组：(3.33 ±0.52)，2-DG 50、100、150、200 mg/kg 依次为：(2.00 ± 0.63)、(1.33±0.52)、(2.00±0.63)、(2.17±0.75)。与假手术组比较，脑缺血再灌注组和2-DG各剂量组的神经行为学评分具有显著性差异(P＜0.01);与脑缺血再灌注组比较，2-DG各剂量组的神经行为学评分减低，差异具有显著性(P＜0.01)，与其他2-DG剂量组比较，100 mg/kg剂量组的神经行为学评分最低(P＜0.05)。

2.2 大鼠脑海马CA1区组织病理形态学变化

HE染色(×400)光学显微镜下观察，假手术组见正常神经元核圆形，边界及核仁清楚。脑缺血再灌注组和2-DG各剂量组均可见正常神经元和损伤神经元：正常神经元核圆形，边界及核仁清楚;损伤神经元胞核肿大，偏位，核仁消失，胞质着色浅、苍白或核浓缩、深染，细胞呈三角形缺血性坏死变化;损伤神经元上述特点在脑缺血再灌注组表现得更明显。与假手术组比较，脑缺血再灌注组和2-DG组可见损伤细胞数目增多，与脑缺血再灌注组比较，2-DG各剂量组能不同程度的改善神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多;与2-DG的其他剂量组相比较，2-DG 100 mg/kg组改善神经细胞的核深染、核固缩程度更加明显，细胞及间质的水肿明显减轻，胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多。见图1(彩插8)。

2.3 各组大鼠海马CA1区GRP78蛋白的阳性表达

与假手术组比较，脑缺血再灌注组和2-DG各剂量组的GRP78蛋白表达差异具有显著性(P＜0.01);与脑缺血再灌注组比较，2-DG各剂量组的GRP78蛋白表达差异均具有显著性(P＜0.01)，而以100 mg/kg剂量组最为明显(P＜0.05)见表1。

2.4 各组大鼠海马CA1区GRP78蛋白的定量表达

与假手术组相比，脑缺血再灌注组和2-DG各剂量组GRP78蛋白表达均增高，差异有显著性(P＜0.01);与脑缺血再灌注组比较，2-DG各剂量组更为明显(P＜0.01)，而 2-DG 100 mg/kg组 GRP78蛋白表达最高(P＜0.05)。见图2和表1。

图2 GRP78蛋白的检测结果Fig.2 The results of GRP78 protein detection

2.5 各组大鼠海马CA1区GRP78 mRNA的表达

与假手术组比较，脑缺血再灌注组和2-DG各剂量组GRP78mRNA表达差异有显著性(P＜0.01)，与脑缺血再灌注组比较，2-DG各剂量组差异有显著性(P＜0.01)，而2-DG 100 mg/kg组 GRP78 mRNA表达最高，与其他2-DG各剂量组比较差异具有显著性(P＜0.05)。见图3和表1。

图3 GRP78mRNA检测结果Fig.3 The results of GRP78 mRNA detection

表1 2-DG对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马CA1区GRP78阳性细胞表达的影响Tab.1 The effect of 2-DG on GRP78-expression positive cells in the ischemic hippocampal CA1 area at the ischemic side

3 讨论

预处理(preconditioning，PC)是指在严重缺血之前给予的各种保护性的/干预性措施，包括缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)、升高体温、药物干预、高压氧等，其中IP是常用方法。IP是指对脑预先进行一次或多次短暂的非致死性缺血刺激后，机体获得对更严重甚至致死性脑缺血的耐受性，表现为脑细胞死亡明显减少，梗死范围大幅缩小、器官功能障碍明显减轻等。这种IP诱导脑组织对随后的脑缺血性损伤产生迟发性的抵抗能力的现象称为脑缺血耐受［5-8］

预处理是目前细胞保护的一大策略［7］，主要涉及缺血预处理、药物预处理和低氧预处理等。鉴于轻度的ERS可促进内质网对蓄积在网腔内的错误折叠或未折叠蛋白的处理，有利于维持细胞的正常功能并使之存活［9］，提示ERS预处理可以作为一种细胞保护的新策略，在 ERS相关疾病中发挥重要作用。

2-DG是一种常见的不可代谢的葡萄糖衍生物，动物实验发现2-DG能诱导GRP78的表达上调，抑制癫痫发作，而且没有观察到任何的副作用［10，11］。它可以迅速进入脑通过己糖激酶途径后以较为稳定的6-磷酸-2-DG的形式积累，后者可以抑制脑细胞内糖的氧化［12］;同时 6-磷酸-2-DG 很难被代谢，可持续性抑制葡萄糖，干扰蛋白质的糖基化［13］。糖基化是内质网内新蛋白合成和分泌的关键步骤，其过程受阻导致未折叠和错折叠蛋白在内质网腔内积累，触发ERS，是ERS的诱导剂，但其最佳剂量还未确定。

GRP78在ERS时表达异常增高，可以看作ERS的标志性蛋白［14］，可促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰，具有保护内质网功能的作用。GRP78还具有维持细胞内钙平衡的作用［15］。因此，GRP78在应激条件下对细胞起保护作用。

从本实验结果可以发现，与脑缺血再灌注组相比，2-DG各剂量组大鼠的神经行为学评分明显减低(P＜0.01)，而以100 mg/kg组评分减低最为明显(P＜0.05);同时亦发现，2-DG各剂量组能不同程度的改善大鼠脑海马CA1区神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜趋于清楚、形态接近正常、核仁清晰可见的神经细胞数目增多，而以2-DG 100 mg/kg组的效果最为明显。提示2-DG对脑缺血再灌注所致的神经细胞损伤具有保护作用，其最佳剂量为100 mg/kg。

研究发现，作为内质网应激标志物的分子伴侣GRP78可促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰，具有保护内质网功能的作用，在 ERS时表达上调，可以看作 ERS的标志性蛋白［16，17］。本实验结果显示，2-DG各剂量组GRP78蛋白表达明显增加，与脑缺血再灌注组比较，差异有显著性(P＜0.01)，提示神经元发生了 ERS;而以100 mg/kg剂量组的GRP78蛋白表达最高，与其他2-DG剂量组比较差异有显著性(P＜0.05)。提示2-DG具有诱导大鼠内质网应激的作用，其最佳剂量是100 mg/kg。

(本文图1见彩插8。)

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Optimization of the dosage of 2-deoxy-glucose in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress

ZHANG Chun-xue1，MIN He-ming2，MIN Lian-qiu1
(1.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;2.College of Basic Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Objective To explore the optimal dosage of 2-deoxy-glucose(2-DG)in the establishment of a mouse model of endoplasmic reticulum stress.Methodes 108 healthy male SD rats were choosen and randomly divided into 6 groups： sham-operation group，ischemia-reperfusion group，2-DG 50 mg/kg group，2-DG 100 mg/kg group，2-DG 150 mg/kg group，2-DG 200 mg/kg group，using different dosage of 2-DG to set up models of endoplasmic reticulum stress.2-DG was dissolved in double distilled water on working concentration of 50 mg/mL and injected into the rat abdomen for 7 days.The sham-operation and ischemia-reperfusion groups were injected with distilled water instead of 2-DG.After ischemia-reperfusion for 12 h，the rats were killed and the neurological function of each group was evaluated and，the pathological changes were observed with HE staining，and the expression of GRP78 was detected by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 mRNA was detected by RT-PCR.Results The scores of 2-DG groups were significantly decreased compared with that in the sham-operation and ischemia-reperfusion group(P＜0.01)，and that of the 2-DG 100 mg/kg group decreased more obviously(P ＜0.05).The 2-DG treatment improved the nerve cell damage，depicting cell membranes more clearly，forming normal cell appearance，and increased number of visible nucleoli in neurons.The improvement in the 2-DG 100 mg/kg group was most significant.The expression of GRP78 was significantly increased in 2-DG groups in comparison with the ischemia-reperfusion group(P ＜0.01).Furthermore，the expression of GRP78 protein in the 2-DG100 mg/kg group was most increased compared with that in other 2-DG groups.Conclusions 2-DG has protective effect on cerebral ischemia-injured neurons and can induce endoplasmic reticulum stress in rat brain at the best dose of 100 mg/kg.

2-deoxyglucose;Endoplasmic reticulum stress;Rats;Animal model

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0074-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.017

辽宁省自然科学基金项目(No.20092192)。

张春雪，女，硕士研究生，E-Mail：zhangchunxue@yahoo.com.cn。

闵连秋，男，教授，主任医师。研究方向：脑血管疾病的基础与临床。E-mail：minlianqiu@163.com。

2010-09-25