眼皮肤白化病研究的新途径及TYR基因2种新突变的分析*

廖沛熙， 李 卓， 逄 婷， 蒋玮莹△， 李洪义△

(1中山大学光华口腔医学院，广东 广州 510080；2香港科技大学理学院生命科学部，中国香港 九龙；3中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广东 广州 510080)

眼皮肤白化病研究的新途径及TYR基因2种新突变的分析*

廖沛熙1， 李 卓2， 逄 婷3， 蒋玮莹3△， 李洪义3△

(1中山大学光华口腔医学院，广东 广州 510080；2香港科技大学理学院生命科学部，中国香港 九龙；3中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广东 广州 510080)

目的探讨自眼皮肤白化病(OCA)患者毛发提取DNA对OCA分型研究的可行性及TYR基因2种新突变的致病性。方法应用毛发压片镜检，PCR扩增毛发DNA中OCA相关基因各外显子、外显子-内含子交界区及启动子区，直接以序列测定技术分析患者基因突变，明确患者的基因型。对于发现的新突变，采用突变等位基因频率等方法对其进行深入研究。结果3个家系的先证者均为1型OCA。家系1的先证者为c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突变的复合杂合子；家系2的先证者为c.896G>A (p.R299H)的纯合子；家系3的先证者为c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突变的复合杂合子。其中，c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突变为至今尚未报道的新突变，通过对新突变进行分析，推测其极可能为病理性新突变。结论本实验成功证实从毛发中提取DNA的方法对OCA分型研究的可行性，同时确定了2种致病性新突变，为今后OCA研究开拓了新的思路和途径。

眼皮肤白化病； 毛发； 基因突变

眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism, OCA)是一组以皮肤、毛发、眼黑色素生物合成障碍以及眼和皮肤功能异常为主要临床表现的疾病[1]。依据致病基因的不同，目前将OCA分为4型[2-5]，分别是酪氨酸酶基因(tyrosinase,TYR)突变导致的OCA1、P蛋白基因(P)突变导致的OCA2、酪氨酸酶相关蛋白1基因(tyrosinase-related protein 1,TYRP1)突变引起的OCA3和溶质载体家族45成员2基因(solute carrier family 45, member 2,SLC45A2)突变所致的OCA4。各型OCA均呈常染色体隐性遗传，具有明显的危害。近年来国内外针对OCA的诊断方法主要是从患者外周血液标本中获取DNA进行分析[6-8]，然而此方法存在创伤性、不安全性以及运输储藏不方便等不足之处。本课题组拟通过从毛球中提取DNA的方法，将毛发应用于眼皮肤白化病的遗传异质性研究中，对于眼皮肤白化病的临床和基因诊断都具有很高的应用价值。

材 料 和 方 法

1材料

3个OCA家系。家系1，先证者，男，8岁，头发白，皮肤白，虹膜淡灰色，瞳孔反光红色，水平中速眼球震颤，无斜视，视力低下。家系2，先证者，女，12岁，头发白，皮肤白，虹膜灰白色，瞳孔反光红色，水平中速眼球震颤，轻度斜视，视力低下。家系3，先证者，女，30岁，头发白，皮肤白，虹膜灰白色，瞳孔反光暗红色，轻度斜视，水平低速眼球震颤，视力低下。3例先证者临床诊断均为OCA1，其父母表型均正常且非近亲婚配，见表1。收集3个OCA家系及50名正常人头发各若干根。无水乙醇清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干待用。

2方法

2.1研究策略 光学显微镜下分别压片观察正常人黑色毛发、正常人白色毛发及白化病患者毛发的毛球结构，拍摄典型形态，以便指导临床诊断。根据临床诊断分析患者毛发DNA的OCA相关基因是否存在突变，随后检测患者父母相应基因的特定位点，明确突变的亲代来源，从而确定患者的OCA基因型。对于新发现的突变，采用突变等位基因频率等方法对其进行深入研究。

2.2毛发基因组DNA提取 取3个OCA家系先证者及其父母毛发各5根，存放20-30 d后，每根毛发靠近毛根约0.5 cm将毛球部剪下，采用海基生物科技有限公司提供的毛发微量基因组DNA提取试剂盒(HaiGene,Cat.No:B0503)，按说明书操作提取毛发基因组DNA。

2.3PCR引物设计与合成 从UCSC Genome Bioinformatics数据库(http://genome.ucsc.edu/)中提取TYR基因(NM_000372)、P基因(NM_000275)、TYRP1基因(NM_000550)和SLC45A2基因(NM_016180)相关序列作为标准序列，根据此序列自行设计特异性引物，扩增范围包括基因全部外显子、外显子-内含子交界区以及启动子区。全部引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。本文涉及的引物序列、相应的扩展产物长度以及退火温度均已列出，见表2。

2.4PCR反应 反应总体系为30 μL，内含Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 2.5 mmol/L，Tag酶1.5 U，上、下游引物各0.17 μmol/L，10×硫酸铵缓冲液3 μL，DNA模板50 ng，超纯水16.5 μL。 扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，按照各自复性温度(50-64 ℃)退火40 s，72 ℃ 50 s，32个循环后，72 ℃ 8 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察和记录扩增结果。

2.5DNA序列测定 OCA相关基因各扩增片段直接测序；对检出的DNA序列变异经双向测序核实后，进一步对其父母相应片段进行序列测定，确定患者及其父母的基因型。纯化和测序工作由上海Invitrogen生物技术有限公司完成。

2.6突变等位基因频率法 对于研究中发现的新突变，通过对50名(100个等位基因)无白化病表型且无亲缘关系的正常人进行新突变等位基因筛查，探讨突变致病的可能性。

结 果

1毛发组织形态学观察

光学显微镜下可观察到正常人黑色毛发、白色毛发、白化病患者(家系1先证者)的毛球及毛干结构，且分别对上述三者5倍、10倍、20倍的成像图进行分析。结果显示，正常人黑色毛发可见明显的毛球及毛干结构，如髓质、皮质、毛小皮等结构；正常人白色毛发可见毛球结构出现明显的退化，髓质、皮质结构不清；白化病患者毛发可见毛球及毛干结构存在，可见髓质、皮质结构，但未见明显黑色髓质及黑色素细胞，见图1。

2家系1OCA1突变分析

家系1先证者毛发DNA的TYR基因第1和第2外显子检测到2种国际白化病数据库已经报道的致病性突变，即c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)，其它扩增片段未见异常。对其父母相应位点进行序列分析，发现父母分别为c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突变的杂合子，故可以肯定先证者为此两种突变的复合杂合子，见图2。

Figure 1. Morphological features of hair bulb tissues (a,×5; b,×10; c,×20). 1: black hair control group; 2: white hair control group; 3: OCA-patient hair group.

图1各组毛发组织形态学改变

Figure 2. Hair DNA sequencing in family 1.

图2家系1的毛发DNA测序结果

3家系2OCA1突变分析

家系2先证者毛发DNA的TYR基因第2外显子检测到1种国际白化病数据库已经报道的纯合性突变c.896G>A (p.R299H)，其它扩增片段未见异常，对其父母相应位点进行序列分析，发现父母分别为c.896G>A (p.R299H)突变的杂合子。故可以肯定先证者为此突变的纯合子，见图3。

Figure 3. Hair DNA sequencing in family 2.

图3家系2成员及正常对照的毛发DNA测序结果

4家系3OCA1突变分析

家系3先证者毛发DNA的TYR基因第1和第4外显子检测到2种国际白化病数据库未见报道的突变，即c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)，其它扩增片段未见异常，对其父母相应位点进行序列分析，发现父母分别为c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突变的杂合子，对上述突变进行生物信息学等相关分析，其为致病性突变的可能性很大。对其弟弟进行上述突变位点的检测，发现其弟弟的基因型与患者相同，均为c.1362+3A>T/c.650G>C(p.R217P)，见图4。

Figure 4. Hair DNA sequencing in family 3.

图4家系3的毛发DNA测序结果

5新突变c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)的分析

上述两种新突变在50名(100个等位基因)无白化病表型且无亲缘关系的正常人中进行筛查时，均未见上述突变。家系3先证者的同胞弟弟也是OCA患者(Ⅱ：2)具有与先证者相同的TYR基因型。c.1362+3位的碱基由A变为T后，破坏了5’端剪接体的结构，可能通过影响mRNA前体剪接的正常进行，改变了翻译后酶蛋白长度，从而影响了酶的催化活性。R217P突变是由碱性亲水性氨基酸(精氨酸)变为中性疏水性氨基酸(脯氨酸)，有研究表明R217位点的突变可引起OCA1A表型，亦可引起OCA1B表型[15]。

表1 本研究3个OCA家系先证者临床表现及基因诊断

*Novel mutations.M:male;F:female.

表2 TYR基因PCR扩增引物

讨 论

眼皮肤白化病具有较高的遗传异质性和等位基因异质性，尽管各种分型OCA患者的皮肤、毛发和眼均具有低色素表型及相应的危害，但不同分型之间以及同型不同个体之间临床表现依然交错重叠、轻重不一，致使临床上仅从症状和体征上难以确诊患者的OCA分型，因而提取患者DNA、分析其基因异质性在优生遗传咨询和产前基因诊断上具有不可替代的作用。

毛发作为人体的皮肤附属器之一，具有分布广泛、易于获取等特点。毛发可分为毛干、毛根和毛球3部分，其中毛球是由毛根和毛囊上皮鞘融合而成。毛球中的毛母质细胞是一种增殖活跃的干细胞，形成毛根和上皮鞘的细胞，故其中含有丰富的染色体等遗传物质[9，10]。此外，毛发的黑素细胞主要存在于毛球的基底部，其合成分泌黑色素颗粒障碍正是引起毛发低色素表现的主要原因。通过光镜观察对比正常人黑色毛发、白色毛发及白化病患者毛发，我们发现白化病患者的毛发基本结构清晰存在，没有发生明显的退化表现，但在毛球部分不能看到明显的黑色素细胞且毛发的髓质颜色较浅，这与白化病患者的临床表现和发病机制相吻合。因此从毛球中提取分析DNA具有组织学上的基础和可行性。

以往对OCA的研究材料多是抽取患者的外周血，但此方法存在不足之处：给患者身体带来一些创伤，血液不便于远途运输；样品获取及提取DNA的过程中会发生一些实验室安全事件等。自Bradifield等[11]首次从头发中提取核酸以来，毛发已成为应用于法医学的常用检测材料之一[12]。但是，毛发应用于眼皮肤白化病的研究至今少有报道[13]，其取样方便、快捷，病人痛苦少，近乎无创，存放时间长。这也符合现今医疗微创、便捷和准确的趋势，对将来OCA诊断和研究方法的改进提供了新思路。

本研究对所发现的两种OCA新突变c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)进行了突变分析，突变IVS4+3A>T通过影响mRNA的正常剪接，导致翻译后酪蛋白长度改变，从而影响酪氨酸酶的催化活性。此外，有文献报道[14,15]c.1362+4A>G和c.1362+5A>G为致病性突变，它们紧邻c.1362+3位点并位于其后。对于c.650G>C(p.R217P)突变，据文献报道，p.R217位点存在p.R217W、p.R217Q和p.R217S 3种突变[16]，都是碱性氨基酸变为中性氨基酸，但在各物种之间蛋白质比对中发现p.R217位点并不保守，说明该位点在酪氨酸酶结构和功能中发挥的作用并非特别重要，它们既可引起OCA1A表型，也可引起OCA1B表型，提示本文发现的c.650G>C(p.R217P)突变同样具有上述特点。家系3先证者及同胞弟弟均有这两种新突变，且他们都是OCA1A的患者，因而进一步支持两种突变具有致病性。另外，对于上述新突变，本研究还在50名(100个等位基因)无白化病表型且无亲缘关系的正常人中进行了筛查，结果均未见上述2种突变，因而我们认为c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突变为致病性新突变。

本实验结果证明从毛发提取DNA进行OCA分型诊断与研究的可行性，为今后推广使用奠定了基础；同时确定了2种致病性新突变，为我国OCA分型诊断、产前基因诊断以及分子发病机制研究积累了重要资料。

[1] Oetting WS, Fryer JP, Shriram S, et al. Oculocutaneous albinism type 1: the last 100 years [J]. Pigment Cell Res, 2003, 16(3):307-311.

[2] Grønskov K, Ek J, Sand A, et al. Birth prevalence and mutation spectrum in danish patients with autosomal recessive albinism [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009, 50(3):1058-1064.

[3] Wei A, Wang Y, Long Y, et al. A comprehensive analysis reveals mutational spectra and common alleles in chinese patients with oculocutaneous albinism [J]. J Invest Dermatol, 2010, 130(3):716-724.

[4] 李洪义，吴维青，郑 辉. 眼皮肤白化病常见亚型的基因与基因突变[J]. 中国优生与遗传杂志，2004, 12(1): 118-121.

[5] 吴维青, 李洪义, 郑 辉. 眼白化病1型的分子病理生理基础[J]. 中国病理生理杂志， 2004，20(2): 278-282、285.

[6] Newton JM, Cohen-Barak O, Hagiwara N, et al. Mutations in the human orthologue of the mouse underwhite gene (uw) underlie a new form of oculocutaneous albinism, OCA4 [J]. Am J Hum Genet, 2001, 69(5): 981-988.

[7] Li H,Wei H,Zheng H, et al. Prenatal diagnosis of oculocutaneous albinism type II and novel mutations in two Chinese families [J]. Prenat Diagn, 2007, 27(6):502-506.

[8] Li H, Meng S, Zheng H, et al. A Chinese case of oculocutaneous albinism type 4 with two novel mutations [J]. Int J Dermatol, 2008, 47(11):1198-1201.

[9] Amory S, Keyser C, Crubézy E, et al. STR typing of ancient DNA extranced from hair shafts of Siberian mummies [J]. Forensic Sci Int, 2007, 166(2-3): 218-229.

[10]Zhang XF, Zhou Q, Lv Y, et al. Ultrasensitive determination of cobalt in single hair by capillary electrophoresis using chemiluminescence detector [J]. Microchem J, 2010, 95(1):80-84.

[11]Bradifield RB, Gray SO. Letter: simplified procedure for field preparation of hair DNA specimens [J]. Lancet, 1975, 1(7903):406.

[12]Sahajpal V, Goyal SP. Identification of a forensic case using microscopy and forensically informative nucleotide sequencing (FINS): a case study of small Indian civet (Viverriculaindica) [J]. Sci Justice, 2010, 50(2):94-97.

[13]Pavarino-Bertelli EC, Rodrigues FC,Bozola AR, et al. Analysis of theTP53 gene in normal skin and hair follicle samples from sun-exposed and non-sun-exposed sites on normal and albino individuals living in southeast Brazil [J]. Arch Dermatol, 1999, 135(12):1559-1560.

[14]Hutton SM, Spritz RA. Comprehensive analysis of oculocutaneous albinism among non-Hispanic Caucasians shows that OCA1 is the most prevalent OCA type [J]. J Invest Dermatol, 2008, 128(10):2442-2450.

[15]Spritz RA, Oh J, Fukai K, et al. Novel mutations of the tyrosinase (TYR) gene in type I oculocutaneous albinism (OCA1) [J]. Hum Mutat, 1997, 10(2):171-174.

[16]King RA, Pietsch J, Fryer JP, et al. Tyrosinase gene mutations in oculocutaneous albinism 1 (OCA1): definition of the phenotype [J]. Hum Genet, 2003, 113(6):502-513.

AnewmethodforoculocutaneousalbinismtypingandanalysisoftwonovelmutationsinTYRgene

LIAO Pei-xi1, LI Zhuo2, PANG Ting3, JIANG Wei-ying3, LI Hong-yi3

(1GuanghuaSchoolofStomatology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DivisionofLifeScience,SchoolofScience,HongKongUniversityofScienceandTechnology,Kowloon,HongKong,China;3DepartmentofMedicalGenetics,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To establish a new approach to oculocutaneous albinism(OCA) classification using the DNA extracted from hair bulb and identify two novel pathogenic mutations inTYRgene.METHODSThe morphological changes of hair bulb tissues were observed under optical microscope. The target DNA fragments of axons, promoter and exon-intron adjacent were amplified by PCR, followed by direct DNA sequencing. The novel mutations were further analyzed using mutant allele frequency method.RESULTSThe 3 probands were all tyrosinase-related OCA(OCA1). The proband in family 1 showed as a compound heterozygote with mutants of c.715C>T (p.R239W) and c.929insC (p.P310PfsX7). The proband in family 2 showed as a homozygote with c.896G>A (p.R299H). The proband in family 3 was a compound heterozygote with mutants of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P). The mutations of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P) were novel. The result of mutant allele frequency indicated that the novel mutations were most likely pathological mutations.CONCLUSIONWe successfully establish a feasible approach to OCA classification using the DNA extracted from hair bulb,and identify two novel mutations.

Oculocutaneous albinism; Hair; Gene mutation

R394.3

A

1000-4718(2011)03-0571-06

2010-11-16

2011-01-17

国家自然科学基金资助项目(No.30672003)；广东省医学科研基金资助项目(No.A2009351)；中山大学医科学生科研项目(No.2009-11)

△通讯作者 Tel: 020-87330828;E-mail: jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.029