超广谱β-内酰胺酶的生物学特性及其检测的研究进展

王美英

随着第三代头孢类抗生素如头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶在临床的广泛使用，细菌的耐药性不断加强，耐药机制日益复杂，超广谱β-内酰胺酶的产生是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)是由质粒介导的能赋予细菌对多种β-内酰胺类抗生素耐药的一类酶，本文就ESBLs分类及来源、特性、流行病学、检测、防治措施等方面综述如下。

1 ESBLs的型别、来源及特性

革兰阴性菌产生的β-内酰胺酶的种类繁多、特性各异。按照与临床紧密结合的BJM分类法，见表1)，可将β-内酰胺酶分为 Group l-4，其中 Group 2be(分子分类 class A)为 ESBLs［1］。在全球范围内至少已发现200多种ESBLs。

表1 β-内酰胺酶的分类

1．1 TEM-3 是第一个被报道的ESBLs表型，来源于TEM-1或TEM-2(不包括对酶抑制剂耐药的β-内酰胺酶，即 IRT)，TEM 型 ESBLs［2］:呈酸性，其等电点(Pl)为:5．2 ～6．5。

1．2 SHV-1 来源的ESBLs(不包括对酶抑制剂耐药的β-内酰胺酶，即 SHV-10)有91种。SHV 型 ESBLs［3］:呈弱碱性，其 pl为:7．0 ～8．2;均由质粒介导。

1．3 CTX-M型ESBLs 是1990年Bauernfeind首次报道的一种对头孢噻肟(cefotaxime)高水解活性的 ESBLs［4］，命名为CTX-M。CTX-型 ESBLs呈碱性，pI为 7．6 ～8．9，均由质粒介导。

1．4 OXA型ESBLs 主要的水解底物是苯唑西林(oxacillin)，因此命名为OXA。OXA型ESBLs属于分子分类的D类，功能分类方案的2 d群。

1．5 OXA 型 ESBLs［5－8］呈弱酸性或弱碱性，其 Pl为:5．5 ～8．1;大多数由质粒介导。

1．6 其他 包括 PER、SFO、GES、TLA、VEB、BES和 CME 等。至目前己发现至少12种基因型，这些基因型的流行范围小，而且检出率低，它们相互之间以及与其他β-内酰胺酶的同源性较低。

1．6．1 PER型ESBLs:在土耳其铜绿假单胞菌中分离出的PER-1是第一个被报道的β-内酰胺酶。

1．6．2 SFO-1 型 ESBLs:与居泉沙雷菌(Serrana fonticola)产生的A类酶高度相关。

1．6．3 GES 型 ESBLs:是 Guiana extended-spectrum β-lactamases的简称。GES-l是1998年在法国Guiana医学中心中临床分离的一株肺炎克雷伯菌中发现的，GES-2是2000年在南非的临床分离的一株铜绿假单胞菌中发现的，两者PI为5．8。

1．6．4 TLA-1型ESBLs:是在墨西哥的一株临床分离大肠埃希菌中发现的，PI为9．0，由质粒介导，对头孢噻肟和头孢他啶耐药，可明显被克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制。

1．6．5 VEB 型 ESBLs:是 Vietnamese extended-spectrum-lactamase的简称，也称CEF-1型酶。VEB-1首次发现于一越南患儿分离到的大肠埃希菌中，PI为5．35，它对氧亚氨基β-内酰胺抗生素高度耐药，在泰国分离到的一株铜绿假单胞菌中也曾发现。

1．6．6 BES 型 ESBLs:是 Brazil extended-spectrum β-lactamases的简称，首次发现于巴西临床分离的18株粘质沙雷菌中，Pl为7．5，对氨曲南、头孢噻肟和头孢他啶高度耐药。

1．6．7 CME型ESBLs:是从脑膜脓毒性黄杆菌(Chryseobacterium meningo-septicum)中分离到的一类ESBLs，由染色体介导，有CME-1和CME-2型，它们对三代头孢菌素高度耐药。

PER-1、PER-2、VEB-1、CME-1 和 TLA-1 之间是相关的，但仅有40%～50%的同源性，可能来源于同一个属。它们都对头孢他啶和氨曲南耐药。

2 ESBLs的流行病学

2．1 ESBLs在不同国家、地区的分布 ESBLs是第三代头孢菌素应用的产物，20世纪80年代早期这些抗生素未上市时，尚无ESBLs，1984年法国从肺炎克雷伯菌检出TEM-3型ESBLs，从此全世界各国纷纷有检出ESBLs的报道，并有爆发流行趋势，但ESBLs的分布各国存在差异，呈明显的区域特征。主要流行的ESBLs型别，德国和韩国为 SHV型，美国、法国为 TEM型［9］，日本、台湾、上海地区为 CTX-M 型［10］，意大利以 SHV 型、CTX-M型为主［11，12］。但近几年欧洲地区逐渐以 CTX-M 为主［13］，美国以 CTX-M-15 最常见［14］。有资料显示，CTX-M 型是我国产ESBLs菌株的主要基因型［15］。北京、上海、杭州、广州、吉林等地都有CTX-M型酶的报道。由于各地区所用抗菌药物不同，所流行的CTX-M基因亚型也有所差异。

2．2 ESBLs在不同细菌间的分布 大多ESBLs是在肠杆菌科细菌特别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出，大肠埃希菌是产生ESBLs的代表菌种，但不同型ESBsL在细菌间的分布有所不同。

2．2．1 TEM型ESBLs:多由大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产生。但最近发现其他肠杆菌科细菌也可产生，如产气肠杆菌、阴沟肠杆菌等。另外，在非肠杆菌科细菌中亦有检出TEM型酶的报告。

2．2．2 SHV型酶:多由肺炎克雷伯菌产生，但在差异柠檬酸杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌等中亦有发现。CTX-M型酶:多从大肠埃希菌、克雷伯菌、沙门菌中分离出来，但在产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌中也有发现。

2．2．3 OXA型酶大多在铜绿假单孢菌中检出，很少有在肠杆菌中检出的报道。

2．2．4 PER型酶:在在铜绿假单胞菌、粪产碱菌、不动杆菌属、沙门菌属中发现。其他型酶在常见细菌中很少见。

2．3 ESBLs在医院病区间的分布 ESBLs菌感染在医院不同科室中的分布存在一定的规律。ESBLs的发生率常以医院ICU、神经内科、老干部病房及呼吸科为最高，小儿ESBLs菌感染处于较高水平［15］。追究其原因，与这些病房患者病情较重、免疫力低下、合并基础疾病、侵袭性操作以及免疫抑制剂的应用等因素有关。大多数研究者认为，引起ESBLs流行有如下危险因素，见表2。

表2 临床ESBLs流行危险因素

3 ESBLs的检测及影响因素

目前除大肠埃希菌、克雷伯菌属及奇异变形杆菌的ESBLs检测有NCCLS推荐法外，其余革兰阴性菌则没有NCCLS推荐的ESBLs检测方法，到目前为止，已建立了多种检测方法［16］。

3．1 初筛实验 通常由常规的药敏试验结果推测产ESBLs细菌。常用的方法为纸片扩散法或肉汤稀释法，前者根据抑菌圈的大小，后者根据MIC的值来推测。此法简单、易行，但准确性差，并且许多产ESBLs的细菌对于检测药物的敏感性无显著减低，易导致假阴性，因而此法只能作为ESBLs的筛选试验。

3．1．1 常规药敏纸片法:抗菌药物直径为头孢他啶(CAZ)≤22 mm，头孢曲松(CRO)≤25 mm，头孢噻肟(CTX)≤27 mm，氨曲南(AZT)≤27 mm，头孢吡肟(FEP)≤22 mm，以上5种抗生素中任一种符合疑为ESBLs菌株。

3．1．2 MIC肉汤法:以上任一种抗生素 MIC≥2 μg/ml即疑为ESBLs菌株。NCCLS 2000 建议头孢泊肟 (CPD)≥1 μg/ml，可初筛ESBLs。虽然CPD在治疗上无意义但在耐药性监测却有独到之处。

3．1．3 双纸片协同试验初筛:将阿莫西林/棒酸纸片置培养皿中央，在其周围20 mm处贴头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南纸片(抗生素纸片购自Oxoid公司)，35℃培养18 h，如在阿莫西林/棒酸纸片与其周围任何一种纸片间出现协同抑菌作用视为ESBLs初筛阳性。双纸片协同试验简便易行，且成本低，适合临床常规实验室。

3．2 确证试验

3．2．1 双纸片扩散法:头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸2组药物进行测定比较，加抑制剂后抑菌环直径与单药时抑菌环直径之差＞5 mm即为 ESBLs菌株。

3．2．2 E-test法:E-test法是瑞士 AB Biodisk公司推出一种商品化的ESBL检测试纸条。E-test试条包括含有及不含棒酸的头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南，棒酸能使MIC值降低8倍以上者为阳性。E-test检测融合了肉汤稀释法和纸片扩散法的优势，无需特殊设备，操作简单不用作繁琐的稀释而能直接报告MIC值(具有7个连续的药物浓度梯度)，而且基本不受接种菌量、细菌生长期以及低酶菌株等影响。

3．2．3 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF):将临床分离菌中初筛的ESBLs进行IEF，测定其pI与已知酶的pI进行比较，具有同一pI的酶可能为同一种酶，如不同则可能为一种新的ESBLs。此法是一种直接、客观的方法，但由于许多新酶与原有酶的pI相同或相近，大多难以用IEF来进行区别，只可作为一种粗筛方法。

3．2．4 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE):实验菌液培养后加溶菌酶与低熔点琼脂混合制成胶块，然后进行溶菌酶切、电泳、染色，分析条带计算菌株之间的相似性系数。如有1～3带的差别，说明细菌间存在单一基因的差异，细菌种系密切相关;有4～6条带的差别，代表细菌有两个独立基因的差异，细菌种系可能相关;有6条以上条带的差别，则说明细菌之间存在3个以上基因的不同，那么被测细菌种系无关联。此法分辨率高、重复性好，是目前最为理想的研究流行病学的分子分型方法。但是细胞融解过程和DNA酶切过程对结果有影响。

3．2．5 聚合酶链反应(PCR):提取待测菌的DNA作为扩增模板，采用已知标准酶基因的特异性引物，进行体外循环扩增，结果如为阳性说明有已知ESBLs的产酶基因。此法灵敏度高，但可出现假阳性，也无法发现新的ESBLs基因，且也无法将广谱酶(TEM-1/2、SHV-1)和ESBLs区分开来。

3．2．6 核苷酸序列分析:将产酶基因进行核苷酸序列分析，分析结果与已知的产ESBLs基因进行比较，发现相同或新的ESBLs基因。此法精密度高，是检测ESBLs的金标准，可以发现新的ESBLs基因以及了解基因突变产生衍生酶的情况。

3．2．7 其他:此外还有Vitek测试法、三维测试法、DNA探针、PCR-单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation polymorphi-sm，PCR-SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)等方法。

4 不同的ESBLs细菌耐药机制

不同的ESBLs对抗菌素耐药主要是由于各自基因序列发生了点突变，这些点突变导致个别酶结构中个别氨基酸的转变。

4．1 酶的基因突变扩大催化腔的空间结构，使第三代头孢菌素能够进入而被水解。

4．2 酶的基因突变提高对第三代头孢菌素的亲和力。

4．3 基因单点或多点突变衍生大量的新型超广谱酶。

4．4 启动子的变化。突变发生在结构基因以外的区域，多数为启动基因或调节基因，往往造成结构基因的过度表达，使产酶量增加而导致耐药。

4．5 孔蛋白的缺失 某些细菌由于膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使某些抗菌药物不能进入菌体内部，或使β-内酰胺抑制剂及其他成分进入被延迟，使抗生素在接触靶位前β-内酰胺酶有更多的时间攻击β-内酰胺抗生素，产生所谓“内在性耐药”或称“固有性耐药［17］”。

4．6 主动外排机制 是造成ESBLs肺炎克雷伯菌形成多重耐药的重要原因。

5 ESBLs细菌的耐药性及抗菌治疗

产ESBLs菌株耐药问题已成为全球最重要的医院内耐药问题之一，儿科医生面临严峻的挑战，因许多抗菌药物对儿童的潜在不良反应［18］，使儿科选药范围受到更多局限，其后果是病原菌的耐药性更快增加。由于产ESBLs菌株具有多重耐药，导致临床治疗更加困难。因此凡临床分离的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌均应监测是否为产ESBLs株，若肯定，无论体外对3代头孢菌素、氨曲南的药敏结果如何，均应报告为对其耐药，即一旦确定为产ESBLs菌株，应首选亚胺培南等碳青酶烯类或哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等头孢菌素类、青霉素和酶抑制剂的复方制剂治疗，可根据药敏合并使用氨基糖苷类抗生素;若为IRH菌株则不能使用酶抑制剂的复方制剂治疗。

6 防治措施

细菌在抗生素选择性压力下，通过基因突变不断产生新的ESBLs细菌，并在各菌株间传播引起爆发流行。Paterson等［19］的研究再次证明ESBLs细菌可以在患者之间传播，因此要加强控制、消毒、隔离等措施。

综上所述，既然产ESBLs的细菌的耐药问题是当前全球重要的医院内耐药问题之一，且易在医院内发生区域性流行，所以要解决革兰阴性菌(尤其是肠杆菌科)产ESBLs的问题，应该限制第三代头孢菌素的应用，同时加强宣传以提高医护人员对ESBLs的认识，从而自觉遵守抗生素的应用原则，并采取相应的措施来防治产ESBLs菌的传播。

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