高效液相色谱法测定康妇舒软胶囊中盐酸小檗碱的含量

高亚雄，杨兴鑫，张晓霞，畅瑞苗，李晓妮 (山西医科大学公共卫生学院，太原 03000;山西医科大学药学院药物分析教研室;通讯作者，E-mail:ninili35@63.com)

康妇舒软胶囊来源于临床经验方，由黄柏、白芍苦参、鸡血藤、桃仁、红花、益母草、龙胆草及泽泻多味中药材组成，具有清热燥湿，活血化瘀，调经止带之功效，临床上主要用于宫颈炎、阴道炎、月经不调、赤白带下、痛经、附件炎等疾病的治疗，效果良好。方中黄柏为君药，具有清热燥湿，泻火解毒，退虚热的功效［1］，现代药理学研究表明，黄柏具有多方面药理作用，主要包括抗菌、抗真菌、抗滴虫以及免疫抑制作用等［2］，其主要成分是盐酸小檗碱［3］。为有效控制康妇舒软胶囊的质量，本文采用高效液相色谱建立了测定该制剂中盐酸小檗碱含量的方法。实验结果表明，该方法准确度高、重现性好，可作为康妇舒软胶囊的质量控制方法。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪(LC-10ATvp型输液泵，SPD-10Avp型紫外－可见光检测器，LC色谱工作站);盐酸小檗碱对照品(批号:110713－200208，纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所;乙腈(山东禹王实业有限公司)为色谱纯，水为三次蒸馏水;其余试剂均为分析纯;康妇灵软胶囊(山西医科大学药学院药物分析实验室自制，规格为每粒0.8 g，批 号 分 别 为 20100427，20100428，20100429，20100513，20100514，20100515，20100516，20100517，20100518，20100519)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验 经过考察色谱填料、流动相组成、柱温及流速对色谱分离的影响，最后确定最佳的色谱条件为:色谱柱 Alltima C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 ml含十二烷基磺酸钠SDS 0.1 g);流速:1.0 ml/min;检测波长:348 nm;柱温:40℃;进样量:20 μl。取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果理论塔板数按盐酸小檗碱计不低于3 000，盐酸小檗碱色谱峰与相邻色谱峰的分离度不低于1.5，且阴性样品无干扰，对照品、供试品及阴性样品色谱图见图1。结果显示，阴性对照在盐酸小檗碱应该出峰的地方(箭头所示)无其他杂质成分的干扰，方法的专属性强。

图1 对照品(A)、样品(B)、不含黄柏阴性样品(C)色谱图Fig 1 High performance liquid chromatograms of reference substance(A)，sample(B)，and negative sample without cortex phellodendri chinensis(C)

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱对照品5.0 mg，置100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为50 μg/ml对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物约0.3 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚80 ml，加热回流1 h，弃去石油醚液，药渣挥去石油醚，置100 ml容量瓶中，加入流动相80 ml，超声处理30 min，放冷，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 取除黄柏外的其余处方量药材，按康妇灵软胶囊制备方法制备缺黄柏的阴性样品，按2.2.2项下方法操作，制成缺黄柏的阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察 取2.2.1项下溶液20 ml，用流动相稀释到 100 ml，精密量取 1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10 ml分别至10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度对照品溶液。在2.1项下的色谱条件下进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线(图2)。盐酸小檗碱的回归方程为:Y=108 730X+9 363.7，r=0.999 8。结果表明:盐酸小檗碱浓度在1－10 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 取2.2.1项下对照品溶液，在2.1项下的色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算盐酸小檗碱色谱峰面积的RSD为0.46%，表明精密度良好。

图2 盐酸小檗碱浓度标准曲线Fig 2 Standard curve of berberine hydrochloride between concentration and peak area

2.5 重复性试验 取康妇舒软胶囊样品(批号为20100429)，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，依法进样测定，计算盐酸小檗碱的平均含量为1.53 mg/粒，RSD 为1.17%，表明重复性好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，12 h进样，测定峰面积。盐酸小檗碱色谱峰面积的RSD为0.66%。结果显示，供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 回收率试验 精密称取盐酸小檗碱对照品2.54 mg，加流动相制成浓度为 0.254 mg/ml的溶液，分别精密移取1 ml加入到已知含量(批号为20100429)的6份样品中，按2.2.2项下方法制备溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。结果表明，盐酸小檗碱的平均回收率为100.46%(RSD=2.34%)，回收率满足分析要求，方法准确。

2.8 样品测定 取10批康妇舒软胶囊，按2.2.2项下的方法处理后进样，记录峰面积，以外标法计算康妇舒软胶囊中盐酸小檗碱的含量，结果见表2。10批样品含量测定结果表明，康妇舒软囊中盐酸小檗碱的含量不应低于1.21 mg/粒。

表1 盐酸小檗碱的加样回收率实验结果 (n=6)Tab 1 Results of recovery test of berberine hydrochloride by HPLC (n=6)

表2 10批样品中盐酸小檗碱含量的测定结果 (n=5)Tab 2 Quantitative analysis results of berberine hydrochloride in 10 batches of samples (n=5)

3 讨论

3.1 提取时间和溶剂用量对提取效果的影响 本文考察不同提取时间(20，30，40，60 min)对盐酸小檗碱提取效果的影响，结果表明，随着提取时间的延长，盐酸小檗碱含量增加，当提取时间超过30 min后，含量增加程度很小，故确定超声时间为30 min时提取效果最佳;此外，对不同的提取溶剂用量(50，80，100 ml)进行考察，结果表明，随溶剂用量的增大，盐酸小檗碱的含量逐渐增加，且溶剂用量为80 ml和100 ml时，盐酸小檗碱的含量相当，故确定最佳的溶剂用量为80 ml。

3.2 流动相的选择 考察了甲醇－水及乙腈 －水－三乙胺，考虑到保留时间、峰形及对柱效影响因素等，最后选择乙腈－0.1%磷酸(50∶50)体系，流速1.0 ml/min，柱温40℃，结果盐酸小檗碱峰的保留时间为16.5 min，柱效高，峰形较好，分离度大于1.5。

3.3 检测波长的选择 在200－400 nm之间，取盐酸小檗碱对照品进行紫外吸收扫描，结果表明在265 nm和348 nm处有两个强吸收峰，参考相关文献［4，5］，确定检测波长为 348 nm。

3.4 小结 本实验采用高效液相色谱法测定康妇舒软胶囊中盐酸小檗碱的含量，方法简单快速、重复性好、准确度高的特点，可作为该制剂的质量控制方法。

［1］ 吴嘉瑞，张冰，张光敏.黄柏药理作用研究进展［J］.亚太传统医药，2009，9(11):160－162.

［2］ 侯小涛，戴航，周江煜.黄柏的药理研究进展［J］.时珍国医国药，2007，18(2):498－500.

［3］ 胡俊青，胡晓.黄柏化学成分和药理作用的现代研究［J］.当代医学，2009，15(7):139－141.

［4］ 李宝明，何丽一.高效液相法测定制霉灭滴胶囊中盐酸小檗碱的含量［J］.药物分析杂志，2000，20(2):128－129.

［5］ 张旭香，张兴运，许志红.薄层扫描法测定长安升白粒中小檗碱的含量［J］.中草药，2002，33(7):619－621.