离心条件对犬精液冷冻保存精子活率的影响

华勇谋　雷莉辉　胡 平　曹授俊　关文怡 （北京农业职业学院畜牧兽医系　102442）



离心条件对犬精液冷冻保存精子活率的影响

华勇谋雷莉辉胡 平曹授俊*关文怡 （北京农业职业学院畜牧兽医系102442）

通过手握法，采集的精液汇集，分成3等份，分别用3种离心条件离心。对离心后的精液进行稀释冷冻。解冻后保存在37℃水浴中，0~6h测定精子活率、对精子活力进行评估。结果表明，解冻后放入37℃水浴中，立即检查，3种离心处理组在0h精子活力、活率差异不显著(P＞0.05)。精子活力、精子活率随保存时间的增加明显下降(P＜0.05)，3组之间变化差异不显著(P＞0.05)。

犬 离心 精液 冷冻保存 精子活率

犬精液冷冻保存技术在犬种资源的保护、品种选育和加快良种进程等方面都能发挥关键作用。自1780年，意大利生理学家SpMlanzani首次用犬进行了人工授精(AI)试验后。Harrop首次对犬的冻精AI进行了试验并获得成功[1]。1965年Harrop和BendorfK等人以牛奶和卵黄-柠檬酸缓冲液稀释犬精液，在5℃条件下精子存活了数天。我国在这方面的起步较晚，目前尚处于试验研究阶段，潘寿文等(1986)、王力波等(1991)、禹学礼等(1997)对犬精液的冷冻保存进行了研究。犬冷冻精液的技术水平还比较低，远远落后于发达国家。

研究发现精清中含有磷脂酶或类磷脂酶等许多物质，这些物质对精子，尤其对冷冻后精子的品质有十分不利的作用[2]。J.M.Cartel在第七届国际家畜繁殖和人工授精会议上首次提出用冲洗离心的方法处理精液，来减少磷脂酶或类磷脂酶对精子的影响[3]。1999 年我国建立了波尔山羊的细管精液冷冻程序，试验中用离心除去精清，加入卵黄稀释液，乙二醇作保护剂，获得了良好的冷冻效果[4]。目前未见离心处理在犬精液低温保存中应用，为明确离心转速对犬精子低温保存的影响，为更好的保存精液，获得高质量的精子而进行了本试验，研究4种离心条件对精液冷冻保存后精子活力、精子活率的影响。

1 试验材料

1.1 试验动物

5只成熟、有生育能力、健康的公犬，年龄2~6岁。饲喂商品犬粮(冠能)，自由饮水，圈养，每日自由活动2次。开始实验前，训练手握法采精。

1.2 药品

（1）三羟甲基氨基甲烷(Tris Base)：Promega Corporation U.S.A.。（2）柠檬酸:北京化学试剂公司。（3）葡萄糖：北京化学试剂公司。（4）甘油：北京化学试剂公司。（5）卵黄：新鲜鸡蛋(北京农业职业学院畜牧场)。（6）青霉素钠：华北制药股份有限公司。（7）硫酸链霉素：华北制药股份有限公司

2 试验方法

2.1 精液采集

利用手握法采精犬的精液，只收集第1、2两部分，第3部分遗弃。采集的精液汇集到一起，保存在37℃水浴中。分成4等份，3份分别用3种离心条件离心，1份作为对照。

2.2 精液质量测定

通过测定精液冷冻-解冻后保存在 37℃水浴中，0~6h测定精子活力、精子活率。

2.3 精液冷冻保存

2.3.1 精液冷冻稀释液 （1）A液：Tris2.4g、柠檬酸1.4g、葡萄糖0.8g、青霉素0.06g、硫酸链霉素0.1g、20卵黄、加蒸馏水至100ml。（2）B液：Tris2.4g、柠檬酸1.4g、葡萄糖0.8g、青霉素0.06g、硫酸链霉素0.1g、12ml甘油、20卵黄、加蒸馏水到100ml。

2.3.2 精液处理 （1）离心：将汇集的精液分成3等分，分别在1000/min×5min，2000/min×5min，3000/min× 5min 3种离心条件离心。（2）稀释平衡：弃掉上层液体(留下0.1ml左右的精清)，用稀释液A液稀释沉淀的精子，稀释后精子密度为2亿/ml。稀释液的温度和精液的温度相同(37℃左右)。37℃水浴5min后，加入等体积的稀释液B稀释，等温稀释后的精液，用4层纱布包裹置于4℃冰箱中降温40min。

2.3.3 精液冷冻与解冻 将平衡后的精液在4℃环境中吸到0.5ml的冷冻管中，封口，在液氮罐口降温熏蒸后投入液氮罐中，37℃水浴解冻，将精液倒进有盖的小离心管中，放在37℃水浴中保存6h。解冻后的精液在第0、2、4和6h进行质量评估。

2.4 数据统计 4次重复实验，数据用SPSS统计软件进行平均数和方差分析统计，用q法进行多重比较。

3 试验结果

见附表。

附表 精液冷冻解冻后0~6h精子活率 (%，Mean±Sd，n=4)

组别0h2h4h6h 1000r/min×5min59.5±4.028.5±3.8a17.9±2.36.6±2.5b 2000r/min×5min57.8±6.125.0±3.6b16.7±3.45.1±2.3b 3000r/min×5min61.3±4.922.3±2.6c15.0±3.810.2±2.5a

注：同列间不同肩标，a、b、c表示差异显著(p<0.05)。

解冻后放入37℃水浴中，立即检查精液质量。1000r/min×5min，2000r/min×5min，3000r/min×5min三种离心处理组的活率分别为59.5±4.0%，57.8±6.1%，61.3± 4.9%，差异不显著(P＞0.05)。活率随保存时间的增加明显下降(P＜0.05)，保存2h时，精液采用1000r/min×5min的离心方式，精子活率较高(P<0.05)，保存6h时，精液采用3000r/min×5min的离心方式，精子活率较高(P<0.05)。

4 讨论

用于冷冻的精液必须符合质量要求，从精液的采集到精液的解冻任何操作都会影响冷冻结果。本试验用3种离心条件对同一份犬的精液进行处理，其它条件都相同，解冻后精液放入37℃水浴中保存6h，每2h进行1次精液精子活率质量检查，精子活率随水浴保存时间的增加而快速下降，0~2h间最为显著(P＜0.05)。3组之间活率和活力从0到6小时间变化差异不显著(P＞0.05)。新鲜精液精子的活率和活力分别为88.5±5.5%和80.2±4.0%，而解冻后0h的活率和活力分别接近60%和50%，解冻后的活率和活率远远低于新鲜精液，两者差异显著(P＜0.05)。

[1] Harrop AE. Artificial insemination of a bitch with preserved semen. Br Vet J， 1954, 110: 424-425 .

[2] 马毅, 曹斌云, 姬云涛. 山羊除精浆冷冻精液的研究进展[J]. 国外畜牧科技, 2001, (4):33-35.

[3] 徐铁铮. 家畜冷冻精液(第3版)[M]. 北京:中国农业科技出版社, 1997.

[4] 赵晓娥, 王光亚, 马保华. 布尔山羊细管冷冻精液研制初报[J]. 西北农业大学学报, 1999 (2): 19-22.

（2011–06–15）

S829.2

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1007-1733(2011)09-0002-02