体内CD8+T细胞剔除对无症状期SHIV感染猴的影响

王 卫，丛 喆，刘 浩，陶 真，刘 强，魏 强，陈志伟，秦 川

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

体内CD8+T细胞剔除对无症状期SHIV感染猴的影响

王 卫1，丛 喆1，刘 浩1，陶 真1，刘 强1，魏 强1，陈志伟2，秦 川1

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 CD8+T细胞在一些病毒感染疾病的免疫反应中起着重要的作用，但CD8+T细胞在HIV无症状期的作用尚不明确，本研究通过体内CD8+T细胞剔除，研究CD8+T细胞对SHIV感染猴的影响，进一步了解艾滋病的发病机制。方法 选择8只SHIV病毒感染的恒河猴，均处于无症状期，随机分成两组，实验组4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8+T抗体cM-T807，不同的时间取外周血、腹股沟淋巴结。流式细胞术测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8+T细胞数目，Real-time RT-PCR法测定实验猴血浆病毒载量，并使用IFN-γ Elispot方法测定其对猴细胞免疫的影响。结果 CD8+T细胞敲除后，4只猴的病毒载量都转阳，但反应性不一，HIV-1的靶细胞CD4+T细胞有轻微下降，后反弹，与病毒载量无相关性;CD8敲除猴的感染情况(血浆病毒载量和CD4细胞)比SHIV病毒急性感染轻，这与ELIPOT结果一致。结论 CD8+T细胞在HIV无症状期发挥重要的作用，但其作用具有个体差别。

SHIV;恒河猴;CD8+T细胞;模型，动物;无症状期

CD8+T细胞在一些病毒性感染疾病的免疫反应中起着重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒发病机理中，发现与病毒复制水平有密切相关［1，2］。近期的研究表明:HIV/SIV特异的CD8+T细胞在整个 HIV-1 感染期间扮演重要作用［3，4］。测定CD8+T细胞的作用，了解其功能有助于阐明体内CD8+T细胞与感染病毒的复制、致病机制的相互作用［5］。研究CD8+T细胞在艾滋病无症状期的作用，确定CD8+T细胞对病毒复制的压制作用，了解CD8+T细胞敲除对HIV-1靶细胞数量的影响，研究该疾病过程与病毒急性感染的异同，分析细胞免疫、体液免疫的反应情况，将进一步了解艾滋病无症状期的致病机理，对艾滋病研究有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:恒河猴4只，由北京协尔鑫生物资源研究所提供［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化饲料饲养。体重3～5 kg。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光抗体检查法(IFA)检查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录 D型病毒(SRV-1，2，5)和猴 T淋巴细胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。所有动物实验在ABSL-3实验室中进行。

1.1.2 毒株:pSHIV-KB9 5′和 pSHIV-KB9 3′由 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供，连接后转染T293细胞得到SHIV-KB9病毒，经PCR鉴定和细胞滴定。

1.1.3 抗体及试剂:抗 CD8+T抗体 cM-T807，由NIH Nonhuman Primate Reagent Resource提供。抗体CD8-FITC(克隆号:DK25)购自 Dako公司，CD3-PE(克隆号:SP34)、CD4-PerCP(克隆号:L200)购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:恒河猴8只，随机分成2组，每组4只。实验组动物分别在0 d经皮下(后颈背部)和3、7 d静脉(后肢静脉)注射cM-T807抗体。第1次剂量10 mg/kg，第2、3次剂量 5 mg/kg。分别在 0、7、14、21、28、42 d 采集外周血 5 mL(EDTA 抗凝)，同时活检取腹股沟淋巴结0.5 mg。另外4只注射0.85%生理盐水作为对照。

1.2.2 临床观察:抗体接种后，每天观察动物临床症状，如摄食量变化、活动情况、精神状态等。

1.2.3 CD8 T细胞绝对数的测定:

1.2.3.1 外周血淋巴细胞悬液的制备:取50 μL的EDTA抗凝血加到12×75 mm Falcon管中，标记抗CD3、CD4、CD8抗体，在室温避光作用 15 min后，加入终浓度10%的溶血素，在4℃下作用10 min。后用 pH 7.2 PBS洗 2次，悬浮于 500 μL的 pH 7.2 PBS中，48 h内上机在 BD Calibur FACS仪上分类计数。

1.2.3.2 淋巴结组织细胞悬液的制备:取体积约为(1×1×1)mm的新鲜淋巴结组织，将其置于盛有0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培养基的小平皿的200目尼龙纱网上，去除包膜，剪碎。以网搓法轻搓组织块，再加入0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培养基冲洗。收集细胞悬液，于200目尼龙纱网过滤。用10%胎牛血清RPMI 1640培养基洗1次，0.4%台盼蓝染液染色计数细胞。调整细胞浓度至106/mL。标记抗 CD3、CD4、CD8抗体，在室温避光作用15 min。用10%胎牛血清RPMI 1640培养基洗2次，悬浮于500 μL的2%多聚甲醛PBS中，48 h内上机在BD Calibur FACS仪上分类计数。

1.2.4 病毒载量的检测:Trizol法提取血浆中病毒RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)Roche LightCycler荧光定量仪测定血浆病毒 RNA载量，该方法灵敏性为103copies/mL［6］。

1.2.5 CD4+T细胞绝对数检测:根据流式细胞仪测定的 CD4+/CD8+比值、血常规结果，计算出CD4+T 细胞绝对数［7］。

1.2.6 细胞免疫反应:用 Monkey IFN-r ELISPOT Kit(U-Cytech，CT126-PR20)检测针对 SIV肽库的IFN-r分泌性 ELISPOT反应，肽库为 NIH提供的SIVmac239肽库，Gag(Item#6204)、Env(Item#6883)、Pol(Item#6443)，反应终浓度为 1.33 μg/mL［8］。

2 结果

2.1 临床表现

cM-T807抗体注射后，实验组动物出现不同程度的消瘦、腹泻等急性感染症状，其中 RH039症状较轻微，RH029症状较重，持续至实验开始后35 d，濒死解剖。对照组动物未见明显异常。

2.2 外周血CD8+T细胞数目变化

在注射抗体后，实验组动物的外周血 CD8+T细胞数目下降迅速，注射后第4天到第21天外周血一直维持在0～2个/μL，之后有轻微上升，到第49天实验结束未回升到初始水平;对照组动物则未见明显特异性变化(图1)。

图1 外周血CD8+T细胞数目变化Fig.1 The number of CD8+T cells in peripheral blood

2.3 淋巴结CD8+T细胞百分比

在明确外周血CD8+T细胞后，还测定了淋巴结CD8+T细胞百分比。结果表明，在抗体注射后21 d，cM-T807实验组CD8+T细胞百分比的均值为4.925%，对照组为23.9%;到抗体效果回复的第49天，cM-T807实验组 CD8+T细胞百分比上升到21.225%，对照组为较接近的24.4%(图2)。

图2 外周淋巴结CD8+T细胞数目Fig.2 The number of CD8+T cells in lymph nodes

2.4 CD4+T细胞绝对数和血浆病毒载量

在抗体注射后，监测实验动物的血浆病毒载量和CD4+T细胞绝对数，发现实验组的血浆病毒载量从开始在检测灵敏线以下上升到104～106copies/mL，其中 RH002和 RH029的水平最高，都在 106copies/mL以上，RH031和 RH039较低，尤其是RH039，仅在第10天检出过一次载量。在整个实验过程中，对照组动物的血浆病毒载量位于检测灵敏线以下(图3)。

在抗体注射后，实验组动物的CD4+T细胞绝对数有轻微的下降，之后回升，而且回升幅度较大，比初始水平高;但RH029动物的CD4+T细胞绝对数一直维持在一个较低的水平，对照组动物未见明显变化。

2.5 CD8+T细胞去除与SHIV 首次感染对比

在CD8+T细胞剔除后，免疫压力降低，病毒大量复制，与病毒首次感染类似。进行两者比较，能更好的分析CD8+T细胞剔除的意义。结果表明，从平均值来看，CD8+T细胞剔除后的病毒复制比首次感染低，首次感染都位于106～108copies/mL之间，而且首次感染病毒复制维持时间较长，在感染后49 d仍能检测出病毒;同时，CD4 T细胞数量有较为严重的下降，尤其以RH019严重(图4)。

2.6 IFN-γ ELISPOT 结果

之后，我们分析了实验猴的细胞免疫，第3周的IFN-γ ELISPOT结果显示，RH039的细胞免疫最强，达到2300 SFC/106PBMC，RH029的细胞免疫最低，RH002和RH031在两者之间，其中与 GAG2和GAG1刺激的斑点为主;与第6周的IFN-γ ELISPOT结果比较，发现RH002和 RH031有一定程度的上升，而RH029更低了，其中gag2刺激的斑点显著增加(图5)。

图3 实验组和对照组动物CD4+T细胞绝对数和血浆病毒载量结果Fig.3 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of the experimental and control groups

图4 CD8+T细胞去除与SHIV首次感染动物CD4+T细胞绝对数和血浆病毒载量结果Fig.4 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of experimental animals after CD8+T cell depletion and SHIV-KB9 first infection

图5 实验组动物注射抗体后第3周和第6周的IFN-γ ELISPOT结果Fig.5 The results of IFN-γ Elispot of experimental animals at 3 weeks and 6 weeks after CD8+T cell depletion

3 讨论

艾滋病是严重威胁人类健康的传染性疾病之一［9］。HIV-1感染的自然史分为急性感染期、无症状期和艾滋病期［10］。根据无症状期的长短，又可以把HIV-1感染者分为快速进展者、长期存活者和典型进展者。研究表明:HIV-1感染者无症状期的状况决定了病程的进展。CD8+T细胞在一些病毒性感染疾病的免疫反应中起着重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒发病机理中，发现与病毒复制水平有密切相关［1，2］。测定 CD8+T细胞的作用，了解其功能有助于阐明体内CD8+T细胞与感染病毒的复制、致病机制的相互作用［5］。近期的研究表明:HIV/SIV特异的CD8+T细胞在整个HIV-1感染期间扮演重要作用［3，4］。在本研究中，使用SHIV恒河猴动物模型，通过体内 CD8细胞的剔除，研究 CD8细胞对艾滋病的影响;这对了解艾滋病发病机制，进行艾滋病疫苗研发具有现实意义。

Schmitz JE 等［11，12］人使用鼠 M-T807 杂交瘤分离出来的重链轻链可变区基因分别连接到人γ1重链和κ轻链基因，连接表达质粒，并传染到 SP2/0-AG14细胞，得到人鼠杂合单克隆抗体，命名为cMT807。并用于印度恒河猴，取得较好的CD8细胞剔除效果。乔红伟等［13］通过 cM-T807抗体注射中国恒河猴建立中国恒河猴CD8+T细胞缺失模型。本实验中，通过类似方法注射剔除实验猴体内CD8细胞，结果成功敲除4只实验猴的 CD8细胞，包括外周血和淋巴结，其效果好于印度恒河猴。

CD8+T细胞敲除后，4只实验猴的病毒载量都阳转，说明在艾滋病无症状期细胞免疫具有一定保护作用，但反应性不一，有的峰值较高，如402、429，有的复制水平较低，如431和439，说明在艾滋病无症状期，CD8细胞参与抑制病毒的复制，但不是唯一的抑制因素。这与ELIPOT结果一致，说明SHIV特异细胞免疫在艾滋病无症状期具有重要的保护作用。429的细胞免疫缺乏，是其发病死亡的原因之一。

CD8+T细胞敲除后，HIV-1的靶细胞－CD4+T细胞有轻微下降，后反弹，与病毒载量具有相关性，这与说明CD4细胞损失主要是因为自身免疫损伤，与病毒复制杀伤关系不大;另一方面，CD4细胞损失后反弹说明猴体本身存在反馈机制，并能不断的补充新生的CD4细胞，证明其免疫再生系统还未衰减，而CD4细胞损失后不反弹或反弹较轻微，如429，可能是由于其免疫再生系统已经衰竭，不能产生新的CD4 T细胞。

CD8+T细胞剔除后，病毒大量复制，刺激免疫系统产生压制作用，相当于进行了一次病毒感染。我们把这次的实验数据与之前相同病毒首次感染4只中国恒河猴的结果进行比较，结果表明，CD8敲除猴的感染情况(血浆病毒载量和 CD4细胞)比SHIV病毒急性感染轻，说明特异性体液免疫在免疫压制病毒复制中具有一定意义。经过CD8敲除，病毒大量复制，相当于进行了一次感染，其GAG2对应的细胞免疫增强，说明这段抗原能有效诱导细胞免疫，其在疫苗设计中具有一定意义。

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Effect of CD8+T Cell Depletion in Vivo on Monkeys with Chronic SHIV-KB9 Infection

WANG Wei1，CONG Zhe1，LIU Hao1，TAO Zhen1，LIU Qiang1，WEI Qiang1，CHEN Zhi-wei2，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

ObjectiveCD8+T cells play an important role in some viral diseases，but the role of CD8+T cells is not yet fully clear in the asymptomatic phase of HIV infection.The aim of this study was to elucidate the impact of CD8+T cell in SHIV-infected monkeys with in vivo CD8+T cells depletion，and to further understand the pathogenesis of AIDS.MethodsEight SHIV-infected rhesus monkeys in the asymptomatic phase were selected and randomly divided into two groups.Anti-CD8+T antibody cM-T807 were injected intravenously into four monkeys on days 0，3，and 7.Then the CD8+T cell number in peripheral blood and lymph nodes in the monkeys were detected by flow cytometry，the plasma viralload by real-time RT-PCR，and the cellular immunity by IFN-γ Elispot assay.ResultsThe viral load of the four monkeys was elevated to above of detected after the CD8+T cell depletion，but the reactions were not uniform.CD4+T cells，the HIV-1 target cells，rebound and dropped slightly.The infection of monkeys with CD8+T cell depletion was lighter than that after the SHIV virus first infection(plasma viral load and CD4 cells)，which was consistent with the Elispot results.Conclusions CD8+T cells play an important role in the asymptomatic phase of HIV-1 infection，but with some interindividual variation.

SHIV，infection;Rhesus monkey;CD8+T cell;Model，animal;Asymptomatic phase

R373;R33

】A

1671-7856(2011)04-0001-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.001

科技重大专项－艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治(2009ZX10004-402，008ZX10001-002)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(DWS 201009)。

王卫(1981－)，男，助理研究员，从事实验动物病毒免疫学研究工作。

秦川，教授，博士生导师，研究方向:实验动物病理学。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-11