基因敲除模型技术及其在眼科研究中的应用现状△

黄 倞 胡 芳 曾祥云

基因敲除是上世纪80年代末发展起来，建立在基因定位整合技术以及小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)体外培养技术基础上的一种新兴生物技术。人类基因组计划的完成，对于人类自身和其他具有重要学术和经济价值的生物的所有基因进行了序列测定。为了进一步揭示已测序基因的功能，对所获大量DNA序列和基因进行结构和功能分析已成为人们日益重视的问题。基因敲除技术能通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而为人们在动物体内分析某一特定基因的功能提供了有力手段。自从1988年人类培育出第一例基因敲除动物模型，揭开基因敲除动物模型建立序幕以来，生命科学的各个领域、各个学科基因敲除动物模型都得到了广泛的应用［1］。在发展迅速的眼科学基础研究中，基因敲除小鼠模型的应用，对于明确特定基因在眼发育及维持正常视觉功能中的作用，提供了准确、高效的研究手段。

1 同源重组基因敲除方法的主要步骤

同源重组作为经典的基因敲除理论，是以胚胎干细胞培养、DNA同源重组(又称基因打靶-gene targeting)和胚胎移植等手段为基础的转基因动物技术［1］。通过将构建的重组载体转染入胚胎干细胞系，从而使目的基因突变，来制作所需的基因敲除动物模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除，依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

1.1 重组载体的构建 在设计重组载体时，通常把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因(如Neo基因、TK基因等)的载体上［2］，成为重组载体。由于基因敲除模型的建立，通常是为了使某一基因失去其生理功能，以观察所造成的表型变化，所以一般设计为替换型载体［2-3］。

1.2 制备ESC ESC可以在体外增殖并维持多潜能未分化的状态，有利于各种体外操作，并具有发育成胚系各种组织的能力。目前的基因敲除技术一般采用鼠ESC，常用的鼠种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。同时具有其他遗传背景的ESC系也逐渐被发展并应用于基因敲除过程中［4-6］。

1.3 同源重组及筛选 在完成对重组载体和ESC的制备之后，将重组载体通过电穿孔或显微注射的方法导入同源ESC中［7］，使外源DNA与ESC基因组中相对应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合入内源基因组中，从而得以表达。由于基因同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为0.01%～1.00%。因此，如何筛选真正发生同源重组的ESC非常重要。目前常用的方法是正负筛选(positive-negative-selection，PNS)法、标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法［8］，该方法中所设计的载体包含10～15 kb大小的靶基因同源片断，一个新霉素抗性基因(neomycin resistant gene，Neor)插入到载体同源序列内的一个外显子中部，作为正选择标记;同时在同源区外插入一个单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)作为负选择标记。载体中插入 Neor基因的主要目的是打断靶基因的编码序列，整合重组细胞的一个选择标记。因Neor基因所携带的氨基糖苷磷酸转移酶活性，能够使其在G418选择性培养基中耐受成活，反之，没有重组进Neor基因的ESC则在选择性培养基中死亡而淘汰。HSV-tk基因位于打靶载体的同源序列与非同源序列之间，反向选择是根据同源重组发生时，同源片段末段将被切除而发生随机整合时，由于HSV-tk基因的存在而使ESC被杀死，通过这种双向选择的方法可使同源重组的筛选效率最高提高2 000倍。

1.4 制成动物模型 将通过标记基因筛选出的发生同源重组的ESC在体外进行扩增。再将带有此ESC的囊胚移植入假孕鼠的子宫内，发育成一个嵌合体(Chimera)。由于同源重组常常发生在一对染色体中的一条染色体上，因此为了使外源基因纯合，必需进一步经过至少2代的杂交传代，以得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，观察目的基因变化前后对小鼠生物学性状的影响［9］。

2 基因敲除技术在眼科的应用

利用上述方法人为的定点修饰、改造基因组中某些基因的结构和组成，并使之在动物个体水平上得以表现和传递，为眼科研究特定基因的功能及相关疾病发病机制提供了有效的分子水平研究平台，同时为许多眼科疾病的基因治疗提供了实验基础。

2.1 眼发育研究中的应用 以视网膜为例，我们已知视网膜主要由6种神经细胞和一种胶质细胞组成，并且这些细胞类型均由视网膜祖细胞按照固定的顺序发育分化而来，并在视网膜的固定层间形成固定的排列。在这一系列复杂的发育分化过程中，存在着大量的基因调控过程，凭借动物基因敲除模型，越来越多的相关基因功能被发现。如在视网膜发育初期，bHLH族转录因子Hes1和Hes5作为关键调控因子直接控制着视网膜祖细胞的数量和增殖状态［10-12］，为视网膜发育过程中出现足够的细胞数量和丰富的细胞类型提供保证［13］。而bHLH族基因Mash1和Math3以及同源结构域基因Chx10为双极细胞发育过程中所必需，其中Mash1和Math3的存在使祖细胞接受双极细胞命运分化为双极细胞，而Chx10则决定双极细胞在视网膜中的特定层间形成固定的排列［13-14］。国外众多学者研究发现，bHLH族基因Math3和NeuroD这2种基因缺失时会造成无长突细胞选择性地减少［15-17］。Inoue等［18］最新的研究发现，HIPK基因家族成员与眼球的发育密切相关，在利用基因敲除技术使 HIPK基因家族成员Hipk1和Hipk2失活之后，发现在眼发育过程中，眼球尺寸整体变小，晶状体和视网膜的层次结构发育异常。证明HIPK基因家族在眼发育后期的正常活性是眼球正常发育的重要因素。Xu等［19］在研究视网膜神经节细胞发育的过程中，利用CD3zeta基因敲除小鼠，观察到当CD3zeta基因缺失时，视网膜神经节细胞的突触发育发生明显障碍，具体表现为神经节细胞的树突数量减少、密度增加，以及一种由谷氨酸介导的选择性突触的活性消失。说明CD3zeta基因在视网膜神经节细胞树突发育及进行正常的生理性信息转导过程中具有重要的作用。在针对感光细胞的研究中，Katoh等［20］研究发现，为了保证在视网膜发育过程中感光细胞能够正常地发育分化，锌指转录因子家族成员Blimp1通过抑制双极细胞命运选择基因Chx10的活性，而保证视网膜祖细胞向感光细胞方向分化。以上的研究成果无一不是通过基因敲除技术建立突变动物模型而成功的，可见基因敲除技术已越来越成为眼科分子水平基础研究中不可或缺的研究平台。

2.2 眼科临床研究中的应用 基因敲除技术不仅在眼科基础研究中发挥了重要的作用，而且在与眼科临床疾病相关的基因诊断和治疗中，基因敲除模型仍具有十分广泛的应用。

2.2.1 眼科遗传病研究 在近期关于眼遗传病的研究中，Boye等［21］利用鸟苷酸环化酶-1基因敲除小鼠模型研究GC1基因与莱伯先天性黑矇的发病密切相关。当GC1基因缺失时，小鼠出现与莱伯先天性黑矇相似的视锥细胞的严重损害;而利用病毒载体使GC1基因持续性过表达时，可以使已受损的视锥细胞功能得到部分的恢复。为这种遗传性疾病的治疗提供了新的思路。在另一种棘手的遗传性眼病-视网膜色素变性的研究中，Budzynski等［22］发现视紫红质的基因突变会造成常染色体显性遗传的视网膜色素变性。在其构建的2种视紫红质基因敲除小鼠模型中，观察到视紫红质基因Y102H和I307N缺失时，会造成光诱导性的视网膜色素变性。这些动物模型将成为研究视紫红质诱导的视网膜色素变性的发病机制和治疗方案的重要工具。

2.2.2 眼表疾病研究 Lu等［23］在研究影响角膜上皮外伤后愈合的影响因素时，应用基因敲除技术制作了Plk3基因敲除小鼠，研究该基因在影响角膜上皮愈合时的作用，结果发现Plk3基因的缺失将严重延迟角膜上皮损伤后的愈合，并且是缺氧条件下细胞数量增生缓慢的重要原因之一。

2.2.3 葡萄膜炎相关研究 葡萄膜炎的病因和治疗一直是临床眼科的难题之一。Sonoda等［24］在研究自身免疫性葡萄膜炎的发病机制时，在小鼠模型中应用基因敲除技术，观察到当CCR2基因缺失、巨噬细胞数量大量减少时，中性粒细胞取而代之并大量增加，最终将导致感光细胞内的视黄醇结合蛋白肽的免疫反应形成以中性粒细胞为主的葡萄膜炎。为葡萄膜炎发病机制的研究提供了新的相关治病基因。

2.2.4 视网膜血管性疾病 随着生活水平的提高，视网膜血管性疾病已成为眼底疾病的主要组成部分。Yanni等［25］在研究视网膜Müller胶质细胞时，发现作为视网膜血管性疾病致病因子血管内皮生长因子的主要来源，Müller细胞所释放的血管内皮生长因子产物受到COX-2基因的调控。当使用缺氧条件诱导血管内皮因子的产生时，COX-2基因敲除小鼠由于COX-2基因的失活，观察发现产生血管内皮生长因子明显减少。说明至少有部分血管内皮生长因子是COX-2基因依赖性的，为许多视网膜血管性疾病的基因治疗提供了新的思路。Zheng等［26］根据糖尿病视网膜病变中氨基丁酸的活性主要是视网膜小动脉松弛，从而增加视网膜血流量、氨基丁酸活性受到明显抑制。利用基因敲除技术，制作了氨基丁酸受体rho-1基因突变小鼠。观察到rho-1在维持视网膜神经递质的稳态平衡中发挥着重要的作用，并且在缺失时会造成视网膜血管发生类似于缺氧状态下的通透性增加的病理变化。

2.2.5 全身性疾病的眼部研究 在关于全身性疾病对眼部影响的最新研究中，Westfall等［27］利用基因敲除小鼠模型，最新观察发现茹贝尔综合征的治病基因Ahi1，当该基因缺失时会造成视网膜感光细胞变性，从而严重影响视功能。

由此可见由基因敲除技术所制作的基因敲除动物模型的应用，对眼科基础研究和临床治疗的发展都起到了巨大的推动作用。

3 基因敲除技术的应用前景

3.1 建立生物模型、研究基因功能 基因敲除技术的最直接作用仍然表现在对基因功能研究中的生物模型建立上。基因敲除技术的优势在于可以建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行针对性较强的特定研究。这些特定的研究目标可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。

3.2 为人类疾病研究服务 在利用生物模型对相关基因在其他生物体中的功能明确之后，人类疾病的发病机制和基因治疗研究便有了可以借鉴的理论依据。通过基因敲除技术研究特定基因的性质以及对机体的影响，对了解疾病的根源或是寻找基因治疗的靶目标都具有重大的意义。同时在进行人类器官移植时，基因敲除技术可以将特定的免疫因子去除或替换，从而使同异源器官移植过程中产生的免疫排异反应降到最低，从而大幅提高各种器官移植手术的成功率。而且通过基因敲除技术，不仅仅能够降低现有生物品种器官移植的排异，还能够对生物体进行定向改造，为培育出新型生物器官以缓解目前的移植供体缺陷提供了重要的技术支持，是遗传工程的重大飞跃。

随着基因敲除技术的不断完善发展，早期的许多不足和缺陷都已经解决，但仍然存在着一些难以克服的缺点。首先敲除掉一个基因所获取的表型改变，并不一定就是该基因功能的准确体现，其原因包括:(1)许多基因家族中成员在功能上是相互联系、共同作用的，敲掉其中一个基因，有可能引起基因家族中其他成员的代偿反应，由于基因功能的相近，可能造成不容易识别的表型;(2)针对一些必需基因的研究，在敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了;(3)由于制作基因敲除小鼠时，采用的动物种系的遗传背景不同，也可能影响到基因敲除后表型的变化。

总之，基因敲除技术是一项十分有前途的技术。随着基因敲除动物模型建立方法的进一步完善，基因敲除技术将更加广泛、有效的在基因功能研究和基因突变、染色体畸变与疾病的关系等领域发挥重要的作用。

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