二甲基联苯胺对斑马鱼胚胎发育及成活率的影响

陈文利 赵梅 杨丽莉 高丽蕙 王合全 王建佳 高翔 陈昌生

·论著·

二甲基联苯胺对斑马鱼胚胎发育及成活率的影响

陈文利 赵梅 杨丽莉 高丽蕙 王合全 王建佳 高翔 陈昌生

目的应用模式生物斑马鱼的胚胎发育技术，研究3，3’-二甲基联苯胺对鱼类胚胎发育的毒性作用和成活率影响。方法受试化合物用甲醇贮备液和蒸馏水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。设空白对照和甲醇溶剂对照各一个，3，3’-二甲基联苯胺的毒性试验浓度分为 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5个，分别选用20 ml的磨口瓶避光贮存。斑马鱼受精卵收集后马上进行药物暴露浸洗试验，每个磨口瓶内放入15枚新采集的受精卵。然后分别放在温度为(28±1)℃的光照培养箱中培养。每2小时观察一次，每次随机抽取3枚受精卵，进行拍照，并显微观察不同浓度的二甲基联苯胺对斑马鱼受精卵及其胚胎发育过程的影响。结果4.32 mg/L以上浓度的药物处理组的斑马鱼受精卵在胚胎发育早期或卵期就全部死亡，病死率达到100%;2.16 mg/L 3，3’-二甲基联苯胺可以引起半数斑马鱼受精卵及其胚胎发育的死亡，2.16 mg/L低浓度的3，3’-二甲基联苯胺对斑马鱼的胚胎发育有一定的加速作用。结论高浓度的二甲基联苯胺对斑马鱼的受精卵及其胚胎发育有严重的毒害和致死作用，2.16 mg/L低浓度的3，3’-二甲基联苯胺对斑马鱼的胚胎发育可能有一定的加速作用。

3，3’-二甲基联苯胺;斑马鱼;胚胎发育;成活率

联苯胺类化合物属于芳香胺类化学物质，在树脂、橡胶、染料等化工产业合成中有广泛应用。以及印染织物的漂洗等多种途径进入环境。由于首先在职业人群中发现膀胱癌的发病率较高，故引起了科学家对联苯胺类化学物质的关注。陈纪纲通过连续18年的健康监护，采用病例对照研究发现联苯胺的职业接触人群中膀胱癌发病率超过1%，是膀胱癌的高危人群［1］。李健等［2］通过用3，3－二氯联苯胺对 A 系小鼠经口灌胃，发现可以导致小鼠恶性肿瘤如肺癌、肝胆癌等发生率增高，研究表明这类化合物对哺乳动物具有直接或潜在的致癌作用，关于联苯胺类化合物对水生生物的毒性研究也有一些报道［3］。近年来斑马鱼胚胎毒性试验以其特有的优势正逐步成为急性毒性试验的替代手段［4，5］，目前有关 3，3’-二甲基联苯胺对斑马鱼胚胎发育影响还未见研究报道。本研究通过对斑马鱼胚胎的急性毒性试验，观察胚胎发育期间二甲基联苯胺暴露所导致鱼卵形态及最终孵化率和成活率的变化，探索其敏感性指标，以填补此类化合物对水生生物毒性数据研究的短缺，进一步完善联苯胺类化合物对水生生物的毒性研究资料，并可为环境卫生标准和职业卫生标准的制定提供科学依据，也为致癌研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料 二甲基联苯胺(3，3’-二甲基联苯胺)由石家庄市职业病防治院提供。分析纯，性能稳定，在水溶液内基本不发生水解、氧化、光解等反应，符合水生毒理学试验要求。

1.2 试验用鱼及其受精卵的采集 斑马鱼为6个月龄以上，体长4 cm左右的红色品种亲鱼。按照雌雄鱼数量约为1∶1的比例放养在25 cm×25 cm×30 cm的玻璃水族箱中，控制溶氧0.6 mg/L以上，水温(26±1)℃，pH 值 8～8.5，水硬度 28～32°dH，光暗比13 h∶11 h。每天喂2次经紫外线消毒处理过的红线虫(水丝蚓)。在缸底铺放一层卵石，以诱发亲鱼自然繁殖产卵受精。根据其间隔性产卵的特点而进行不间断的观察，以便及时收集受精卵并转移到预先配制好的蒸馏水内。为尽量避免自来水中所含物质干扰试验结果，受精卵和胚胎发育试验的用水，均为统一配制、充氧饱和、温度恒定的蒸馏水。未受精卵在1～2 h内会变为乳白色，用吸管及时剔出。

1.3 仪器设备 (1)DMBA300-C数码照相显微镜;(2)光照培养箱;(3)可控温加热器;(4)充氧泵;(5)水族箱等。

1.4 方法 按照OECD的要求设计胚胎毒性试验［6］，受试化合物用甲醇贮备液和蒸馏水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。设空白对照和甲醇溶剂对照各1个，3，3’-二甲基联苯胺的毒性试验浓度分为 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5个，分别选用20 ml的磨口瓶避光贮存。根据以往的研究，胚胎对芳香族化合物的吸收随着暴露浓度的增大和时间延长胚胎体内的化合物含量不断增大直至死亡，而在胚胎发育早期更容易吸收。一般认为，器官早期(原肠胚期前，受精后0～8 h)胚胎对致畸原最为敏感［7］。因此，受精卵收集后马上进行药物暴露浸洗试验，每个磨口瓶内放入15枚新采集的受精卵。然后分别放在温度为(28±1)℃的光照培养箱中培养。每2小时观察1次，观察、统计不同药物浓度处理后在不同发育时间内受精卵的发育过程、病死率和成活率等，每次随机抽取3枚受精卵，进行显微观察和拍照。

2 结果

2.1 不同浓度的二甲基联苯胺对斑马鱼受精卵及其胚胎发育过程的影响 见表1。

表1 不同浓度二甲基联苯胺处理下斑马鱼受精卵及其胚胎发育的状况

2.2 不同浓度二甲基联苯胺对斑马鱼胚胎发育成活率的影响见表2。

表2 不同浓度二甲基联苯胺处理下斑马鱼胚胎发育的成活率

3 讨论

根据静态观察标准，参照蔡翔等［8］的方法，把斑马鱼的早期胚胎发育过程分为3个时期:(1)单细胞期。受精卵外有较厚的透明胶膜，卵内密布卵黄颗粒。受精后10 min动物极出现。(2)囊胚期。卵裂后期，胚盘卵裂球数渐增，卵裂球间的细胞界限渐变模糊，胚盘高矗于卵黄上，此即囊胚早期。到囊胚晚期，囊胚表面细胞向卵黄部分下包，胚盘变成弓状。(3)原肠胚期。胚盘细胞下包至卵黄1/2处时，整个囊胚边缘处形成略厚的胚环，其上层细胞为外胚层，下层细胞为内胚层，胚环背侧增厚形成胚盾。

表1可见，在2 h内，由于暴露处理时间很短，各处理组的受精卵没有明显的变化，受精卵呈透明状，能看到卵的动物极出现2或4个细胞的卵裂早期现象。蒸馏水对照组和甲醇溶剂(≤0.3%)对照组的受精卵在每个时间段内基本都能够正常的发育，依次经历囊胚期、原肠期、体腔的形成、体节分化、鱼形期，至到孵化为仔鱼。说明低于0.3%浓度的甲醇助剂，不会造成斑马鱼胚胎发育的异常。2.16 mg/L药物处理组的受精卵也能按照上述发育历程发育并孵化出仔鱼，但是整个发育时间比对照组提前大约24 h，并且还有一些身体微小、头大尾小的畸形个体出现。这和以往的研究有相似之处，刘红玲等［8］提出低浓度的二甲基联苯胺能促进胚胎发育，而高浓二甲基联苯胺则抑制胚胎发育。有关低浓度的二甲基联苯胺为何能加速胚胎发育，导致畸形个体出现有待今后进一步的研究。

4.32 mg/L药物处理组的斑马鱼卵少数能够发育为囊胚，但4 h后多数出现囊胚的变形，随后就是卵黄的凝聚与胚胎死亡，8～12 h内，胚胎全部死亡。6.48 mg/L以上药物处理组的受精卵都不能发育为囊胚期，很早就表现出明显的卵黄凝聚反应而使受精卵快速死亡。这说明4.32 mg/L左右的3，3’-二甲基联苯胺可能是斑马鱼受精卵和胚胎发育的致死的临界浓度。死亡的受精卵或胚胎都表现出卵黄凝聚，这可能是高浓度的二甲基联苯胺类物质能够引起蛋白质的变性所导致的。以往的研究认为，在受精后0～8 h，原肠胚之前这段时间内，胚胎被暴露在高浓度的有毒化合物中，可能会导致遗传物质改变或蛋白质的凝聚反应，这种损伤是不可修复的［9］。

由表2可见，蒸馏水对照和甲醇溶剂对照处理下，斑马鱼受精卵胚胎发育的成活率分别达到了96.8%和96.4%，差异无统计学意义(P＞0.05)。进一步说明了低于0.3%的甲醇溶剂对鱼卵发育没有明显影响，可以作为有机物水环境染毒实验的安全助溶剂。

4.32 mg/L以上浓度的药物处理组的斑马鱼受精卵在胚胎发育早期或卵期就全部死亡，病死率达到100%，说明高浓度的3，3’-二甲基联苯胺对鱼卵及其胚胎毒性作用很强。2.16 mg/L的二甲基联苯胺暴露处理后，有约1/2的胚胎死亡或致畸而死，还有约1/2的受精卵(46.8%)能够发育并孵化为仔鱼，基本说明该浓度可能是影响斑马鱼受精卵及其胚胎发育的临界浓度。2.16 mg/L 3，3’-二甲基联苯胺可以作为影响水生生物生存的一个限定指标。(1)低于0.3%(体积分数)浓度的甲醇溶液，对斑马鱼的受精卵和胚胎发育无明显影响，可作为有机物水环境染毒实验的安全助溶剂。(2)高浓度的3，3’-二甲基联苯胺对斑马鱼的受精卵及其胚胎发育有严重的毒害和致死作用，4.32 mg/L左右可以使是斑马鱼受精卵及其胚胎发育全部致死，因此该浓度可能是一个致死临界浓度。(3)2.16 mg/L 3，3’-二甲基联苯胺可以引起半数斑马鱼受精卵及其胚胎发育的死亡，可以作为影响和评价水生生物生存的一个限定性毒理指标。(4)除了致死和致畸作用外，2.16 mg/L低浓度的3，3’-二甲基联苯胺对斑马鱼的胚胎发育可能有一定的加速作用，有待今后进一步研究。

1 陈纪刚.上海市联苯胺接触人群职业性膀胱癌的医学监护.中国肿瘤，2001，10:206-209.

2 李健，黄超，窦桂荣.3，3-二氯联苯胺经口诱发A系小鼠实验肿瘤的观察.癌变·畸变·突变，2003，15:81-84.

3 Schulte C，Nagel R.Test acute toxicity in the embryo of zebrafish，Brachydanio rerio，as an alternative to the acute fish test:Preliminary results.ATLA，1994，22:12-19.

4 朱琳，史淑洁.斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中的应用.应用生态学报，2002，13:252-254.

5 端正花，张斌田，朱琳.双酚A对斑马鱼胚胎发育各阶段的毒性及生物蓄积.中国环境科学，2008，28:260-263.

6 OECD.Guideline for testing of chemicals:Fish，embryo toxicity test with the zebrafish(Brerio).OECD，1996，62-76.

7 刘红玲，于红霞.联苯胺类化合物对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究.生态毒理学报，2007，2:94-99.

8 蔡翔，王捷，王颖.应用胚胎检测技术评价氟吗啉对斑马鱼胚胎—幼体发育的影响.农药，2005，44:271-273.

R 321-33

A

1002－7386(2011)17－2610－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.17.021

项目来源:河北省科技支撑计划项目(编号:072761891)

050031 河北省石家庄市职业病防治院(陈文利、杨丽莉、高丽蕙);河北省自然科学基金委员会(赵梅);河北省水产技术推广站(王合全);河北师范大学(王建佳、高翔、陈昌生)

1.5 标准及指标 试验过程中，受精卵的死亡按照发育过程中卵黄出现凝集为准;胚胎死亡按照没有身体运动、没有心动、身体变浑不透明为准。成活率以仔鱼从胚胎孵化出来之后的成活个体计算。成活率为每百粒卵能发育到48 h并孵化为仔鱼的卵数。

2011－03－15)