远志等中药对脑淀粉样血管病相关蛋白胱抑素聚集的影响*

何剑为，马婧思，于东润，张 朔，邹志远，宋有涛,2△

(辽宁大学：1.生命科学院;2.环境学院,沈阳 110036)

脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy,CAA) 是一种常发生于老年人的微血管疾病，临床以血管壁弹力下降，最终引起颅内反复出血为主要表现，病理特征为在脑小血管的内壁出现严重的淀粉样蛋白沉积[1]。引发CAA的重要原因之一就是编码人胱抑素C(human cystatin C，HCC)的基因发生突变(L68Q)，改变了蛋白的稳定结构，进一步形成类淀粉样纤维沉淀而导致疾病。HCC突变体L68Q在致病机制上与引发疯牛病、老年痴呆症等神经退行性疾病的病原蛋白相似，即通过蛋白质的构象改变，发生分子间交联形成二聚体，进一步形成类淀粉样纤维沉淀而导致疾病[2]。目前对于这些蛋白质淀粉样沉积疾病尚无有效的治疗手段。

近年来，国外研究团队在多种淀粉样疾病的研究中筛选到一些具有抑制病原蛋白聚集的天然药物化学组成成分，如芳香性生物碱菲啶和菲啶类衍生物具有明显的抗朊病毒聚集作用[3]，多酚类物质没食子儿茶素和没食子酸酯具有一定的抗朊病毒和阿尔茨海默病的治疗效果[4]。另一方面，国内王学美[5]也报道了补肾类中药对早发性老年痴呆症具有一定的功效。迄今为止，发现的可以治疗这两种淀粉样蛋白病的中药配方包括菖蒲、远志、人参、甘草、黄芪、柑桔、半夏、天麻、日本芎草穷、红牡丹、枣、地黄、枸杞果实、当归、肉苁蓉、巴戟天、乌头、薯蓣、茯苓、银杏、川芎、绞股蓝、五味子、烟草、蛇床、芍药、吴茱萸、姜黄、首乌、三七、大黄等[6-7]。然而，有关中药对由胱抑素蛋白聚集引起的脑淀粉样血管病影响的研究目前国内、外尚无报道。此外，以上研究主要局限在临床的治疗效果上，中药对于淀粉样蛋白聚集的影响迄今也鲜有报道，这也成为中药临床使用的相关药理学研究方面的一大缺陷。

因此，本研究利用分子生物学结合生物化学的方法，用毕赤酵母中表达的重组鸡胱抑素(chicken cystatin，cC)突变体I66Q作为模型，选取银杏叶、大黄、烟草、五味子、当归、甘草、川穹、茯苓、绞股蓝、吴茱萸、蛇床、姜黄、首乌、芍药、远志和三七等18种中药材作为研究材料，采取向毕赤酵母培养基中直接添加中药生药并灭菌处理的方式(该处理方法与中药的清蒸炮制方法相似)，通过研究中药对胱抑素聚集特性的影响，以期筛选出具有抑制胱抑素淀粉样聚集的药物。这对于寻找由HCC引起的CAA的治疗药物及为中药治疗蛋白淀粉样聚集疾病的药理学研究具有重要的推动作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 转入pPICZαA-cC-I66Q质粒的酵母菌株PichiapastorisX-33；毕赤酵母购自Invitroge公司，胱抑素酵母表达菌株为本实验室构建。

1.1.2培养基 YPD(yeast extract peptone dextrose medium)：蛋白胨2%,酵母浸粉1%,葡萄糖2%，YPD固体培养基加入2%的琼脂粉，在115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。液体培养基室温保存，蛋白胨、酵母浸粉，葡萄糖均购自上海奥博星生物科技有限公司。YPM(buffered yeast extract peptone medium)：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，在121 ℃高压蒸汽灭菌25 min。加入0.5%甲醇诱导表达。

1.1.3中药生药 银杏、川芎、甘草、当归、绞股蓝、五味子、烟草、蛇床、芍药、吴茱萸、姜黄、远志、茯苓、首乌、三七、大黄等均购于沈阳市东北大药房，两面针购于安徽省亳州市真源堂药业有限公司。

1.2方法

1.2.1胱抑素的诱导表达及收集 毕赤酵母在5 mL YPD培养基中小量培养12 h，200 mL YPD培养基中30 ℃扩大培养24 h至OD为3.8～4.2，4 ℃ 5 000 g离心10 min收集菌体，转入加有浓度为500 μg/mL的不同中药原料的100 mL YPM培养基中[8]，调整各培养液OD值在1.6～1.8之间，诱导表达3 d,毎24 h补加1次甲醇。中药按500 μg/mL直接加到YPM培养基中，灭菌。诱导表达结束，4 ℃ 5 000 g离心10 min除去菌体，实验方法参照文献[9]。

1.2.2十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 SDS电泳实验方法参照文献[9]。结果用全自动图像分析系统 DolpHin-DOC进行扫描、分析。电泳仪购自BIO-RAD 公司，DolpHin-DOC凝胶成像系统购自Wealtec公司。

1.2.3微生物血细胞计数板直接计数法 把菌体在加有浓度为500 μg/mL不同中药的YPD培养基中培养24 h。取稀释到100倍的菌液，从盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，本实验用的是25×16计数板，计数4个角上中方格的菌数和中央中格的菌数，之后用公式计算。

1.2.4破碎细胞 将24、48、72 h诱导表达后的菌体4 ℃ 4 000 g离心10 min收集，试验方法参照文献[13]。

1.2.5Western blotting[9]将提取细胞内总蛋白进行12% SDS-PAGE 电泳后转膜(PVDF膜)，恒压100V，50 min。5%脱脂奶粉液封膜1 h，一抗兔抗cC(实验室自制)采用1∶2 000稀释，缓和震荡1 h，二抗羊抗兔IgG采用1∶5 000稀释，缓和震荡1 h，显影。显影用增强化学发光法试剂购自碧云天生物有限公司，兔抗IgG抗体及兔抗绵羊IgG二抗购自金斯特生物科技有限公司。

2 结 果

2.1初筛18种中药对胱抑素聚集的影响 本实验用盐析结合SDS-PAGE的方法检测中药对于胞外分泌cC蛋白聚集情况的作用效果。10%硫酸铵盐析所得为胱抑素不溶物及多聚体部分，45%盐析为寡聚体部分，60%盐析为单倍体部分[9]。药物筛选的结果大致分为3种情况：(1)蛋白多聚体和寡聚体的含量较未加中药的胱抑素突变体I66Q样品(以下简称对照组)明显减少的：远志、芍药、姜黄、吴茱萸、大黄；(2)实验组和对照组的多聚体和寡聚体的蛋白含量相差不显著的：蛇床、甘草、三七、茯苓、银杏、绞股蓝、首乌、五味子、川芎、烟草；(3)实验组多聚体和寡聚体的蛋白含量明显较对照组多的：两面针、当归。图1具体显示了其中代表性的中药(如远志、三七和当归)的作用效果，结果表明远志对于胱抑素生成多聚体和寡聚体有明显的抑制作用。此外，对于加药后的菌液用微生物血细胞计数板直接计数法统计培养基中的细胞数，结果表明除了烟草和芍药对细胞生长有一定的抑制作用之外，其他中药对细胞数没有显著的影响，见表1。

2.2远志对胱抑素聚集影响的剂量效应 为了研究不同浓度远志对胱抑素聚集的影响，笔者检测了100、250、500、1 000、5 000 μg/mL的远志对胱抑素单倍体、寡聚体和多聚体形成的影响。如图2所示，远志的浓度在500 μg/mL以下时，药物剂量与抑制胱抑素聚集效果呈现较好的正相关性；而远志的浓度大于500 μg/mL时，虽然单倍体含量有一定程度的下降，但寡聚体含量呈逐渐上升的趋势，表明药物剂量与抑制胱抑素聚集效果呈现负相关性。这说明远志抑制胱抑素聚集的最佳浓度为500 μg/mL。

表1 初筛18种中药对胱抑素聚集的影响

A:10%盐析后SDS-PAGE的结果；B:45%盐析后SDS-PAGE的结果；C:60%盐析后SDS-PAGE的结果；D:基于以上SDS-PAGE结果，应用密度梯度检测仪检测培养液中的不同组分含量。

图1远志、三七和当归对cC蛋白突变体I66Q聚集的影响

2.3远志对胱抑素胞内聚集的影响 为了全面地分析远志对胱抑素聚集的作用效果，笔者利用蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测了远志对细胞内胱抑素聚集的影响。加有远志的酵母细胞内胱抑素的单倍体、二倍体的比例与对照组相比没有明显区别。这说明远志可能直接作用于分泌到细胞外的胱抑素，而对于胞内的蛋白没有作用。由于相对分子质量大小的原因，中药成分可能较难进入由溶酶体等亚细胞器形成的胞内区间[10]，见图3。

A：10%盐析后SDS-PAGE的结果；B：45%盐析后SDS-PAGE的结果；C：60%盐析后SDS-PAGE的结果；D：基于SDS-PAGE结果，应用密度梯度检测仪检测培养液中的不同组分含量。

图2不同浓度的远志对胱抑素聚集的影响

图3 Western blotting分析胞内水平远志对cC蛋白聚集的影响

3 讨 论

HCC由于在生理条件下也非常容易聚集，且大部分形成二聚体[11]，这为该领域的研究带来了诸多困难。在其替代模型寻找过程中研究者发现，cC与HCC同属于Cystatin超家族Ⅱ型，二者具有高度同源性[12]。cC与HCC相比有更高的热力学稳定性，与HCC易于形成二聚体不同，cC在生理条件下主要以单体形式存在[13]，这为相关蛋白质生化实验提供了便利可操作的优势，也成为本实验构建的药物筛选模型的理论基础。

本研究利用毕赤酵母表达的cC的突变体I66Q菌株，采用SDS-PAGE结合密度梯度蛋白测定技术以及免疫印迹法在胞内和胞外定量分析了多种单方中药对cC突变体I66Q的聚集的影响。研究结果表明，远志、芍药、姜黄、吴茱萸、大黄在胞外水平上对cC突变体I66Q的聚集有明显的抑制作用,而远志的作用最为明显，接下来更深一步地研究远志对cC突变体I66Q的聚集情况的影响，通过剂量效应分析显示，远志对cC淀粉样聚集的抑制浓度区间为小于等于500 μg/mL，在高于此浓度时，远志的剂量与cC淀粉样聚集呈负相关。

本研究所使用的表达体系为基于毕赤酵母的外源蛋白表达体系，由于在构建重组质粒时将cC的cDNA直接与前端的毕赤酵母自身的分泌信号肽序列连接，因此经翻译、折叠、修饰的外源蛋白直接分泌至胞外，毕赤酵母的自身蛋白分泌量极小，加上毕赤酵母生长培养基中只有少量的蛋白[14]，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成分，可作为蛋白纯化的第一步，因此，在研究中采取的在培养基中直接加入的中药成分应主要作用于外源分泌蛋白，即cC的单体及二聚体。由HCC引起的CCA的致病原因是由于HCC的突变体L68Q通过结构域交换形成二聚体，二聚体进一步聚集在血管内形成淀粉样纤维沉淀，进而引发CCA，本实验结果显示，亚适量浓度的远志在一定程度上能有效抑制cC的二聚体及多聚体的形成，由此可以推测，有抑制寡聚体形成的中药成分将可作为潜在的HCC关联CCA的候选治疗药物。

基于HCC的一级蛋白质结构，HCC在哺乳动物细胞中表达的绝大部分为分泌蛋白，少部分存留于细胞区间的溶酶体系统，为深入分析中药成分对胱抑素的聚集影响，进一步通过细胞裂解，应用免疫印迹法检测了远志对胞内HCC的影响，结果显示在胞内水平上并没有明显的影响，提示由于相对分子量大小的原因，中药成分可能较难进入由溶酶体等亚细胞器形成的胞内区间。

对中药成分抑制HCC寡聚体形成的深入研究将有助于理解小分子化合物抑制淀粉样聚集的抑制机制，从而有利于开发出潜在的基于中草药物的HCC关联CCA的新疗法。

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