药用植物人参的组织培养研究进展

左北梅，高文远，董艳艳，刘辉，王娟

(1.天津科技大学，天津 300457；2.天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072；3.天津中医药大学，天津 300193)

药用植物人参的组织培养研究进展

左北梅1，高文远2*，董艳艳3，刘辉1，王娟2

(1.天津科技大学，天津 300457；2.天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072；3.天津中医药大学，天津 300193)

从人参愈伤组织培养、人参细胞悬浮培养、人参体细胞胚胎培养、人参毛状根培养、人参不定根培养等方面，综述了人参组织培养的研究进展，为人参资源的研究提供参考。

人参；愈伤组织；悬浮细胞；体细胞胚胎；毛状根；不定根

人参PanaxginsengC.A.Meyer为五加科人参属珍贵药用植物，其根可入药，被誉为药中之王。含有多种人参皂苷、人参多糖等多种物质，可增强机体对各种应激刺激的非特异抵抗力，具有抗衰老、免疫调节、降血糖、保肝护肝、抗肿瘤等多种医疗保健功效[1]。由于人参重要的药用价值，也成为组织培养的热点研究植物，本文综述了人参组织培养的主要研究成果，为人参资源的研究提供参考。

1 人参愈伤组织培养的研究

可用于诱导人参愈伤组织采用的外植体主要是人参的根、茎、叶片、叶柄、花药、花丝、子房、果肉、原生质体等，以根和茎作为外植体最为常见。早在1964年，中国科学院植物生理研究所罗士韦教授首先采用人参根为外植体，培养于改良的Heller培养基中形成了愈伤组织，继代培养移植4次取得成功[2]。1968年，Butenko等成功从人参叶柄、叶片、花冠柄和根的外植体上诱导出愈伤组织。随后，美国、日本、印度、朝鲜等国家相继开展了人参组织培养的研究，促使人参愈伤组织培养的研究在全球开展起来。

朱蔚华教授等[3]报道不同培养基上人参愈伤组织诱导频率和生长速度的不同。人参愈伤组织适宜的培养基为附加10 %的Whise、MS、修改FOX，其中以修改FOX培养墓愈伤组织诱导率最高，愈伤组织生长速度以SH培养基最快。而人参愈伤组织诱导和培养用得最多的培养基是MS基本培养基，采用MS、N6、B5、Bla·es、I、FOX和修改MS等培养基均能获得愈伤组织。

大量研究集中在植物生长调节剂对人参愈伤组织培养各阶段调节作用。古谷力[4]研究证实，2,4-D的最适浓度为0.5～2 mg·L-1对人参愈伤组织的诱导具有良好的效果。朱蔚华等[5]指出：适当浓度的2,4-D对人参愈伤组织生长有显著的效果，最适浓度为5 mg·L-1。6-BA对人参愈伤组织的生长也有一定的促进作用，以0.1 mg·L-1生长最快。郭生祯等[6]进一步比较了不同种类激素的浓度对人参愈伤组织诱导的影响。确定了诱导愈伤组织使用的激素，2,4-D起了主导作用，最适浓度为0.5～2 mg·L-1，如过低或过高，诱导频率呈下降趋势；NAA对诱导愈伤组织也有一定的作用，以2～6 mg·L-1较适宜，低于此浓度愈伤组织则很少发生；其他激素如IAA、6-BA、CA等配合使用，也能获得较好的效果，但作用不显著。

另外，田鹏玮等[7]对草酸促进人参愈伤组织细胞生长和人参多糖与皂苷积累进行了研究，指出光照和培养温度对草酸的诱导效果有很大影响，其中在12 h·d-1的光照下，0.01～1 mmol·L- 1的草酸对细胞生长和皂苷积累都有促进作用，然而，10 mmol·L- 1的草酸对多糖积累有促进作用；在4个温度(22,24,26,28 ℃)水平下，随着培养温度的升高,添加草酸对细胞生长的抑制作用增强，但有利于多糖和皂苷的积累。张磊等[8]研究了NO供体硝普钠(SNP)在光照胁迫下对人参愈伤组织细胞生长及次生代谢积累的影响，利用人参愈伤组织培养体系，给予光照5 000 lx，每天8 h光照，通过在不同时间向培养基中添加不同浓度的SNP溶液，结果表明强光对人参愈伤组织的危害程度降低，酶活性及次生代产物的积累明显增加。

此外，人胰岛素已在人参愈伤组织细胞中成功表达。汪春义等[9]将已构建成的植物表达载体PB1 121/( CTB BA )转入农杆菌LBA4404，通过农杆菌与人参愈伤组织的共培养，将人胰岛素基因整合到人参愈伤组织细胞中，对其表达产物进行检测，并用小鼠进行降糖试验。结果表明，Western blot检测显示，在相对分子质量约17000处有特异蛋白反应带。ELISA法检测人胰岛素表达量为5.31 μIU·mL-1。小鼠降糖试验表明人参愈伤组织细胞有降血糖的作用，而转化的人参愈伤组织细胞降血糖作用更明显，成功建立了表达人胰岛素的人参愈伤组织细胞系。

许多学者对影响愈伤组织诱导和生长所添加的外源激素、最适培养基、培养基的天然补充营养物质、水质等因子进行了考察。然而，人参愈伤组织生长较为缓慢，在固态培养基中操作起来较为复杂，培养物中的活性成分含量也一般大大低于天然植株，这些都大大限制了其在大规模生产中的应用。

2 人参细胞悬浮培养的研究

植物细胞悬浮培养的研究是植物组织培养走向工业化生产的重要步骤。与植物愈伤组织的固体静止培养相比，植物细胞液体悬浮培养的优点主要是细胞增殖速度快、能提供大量均匀一致的培养物以及能进行大规模培养。早在20世纪80年代日本就已经实现了人参细胞的大规模工业化生产。

人参细胞悬浮培养的研究主要包括以下几方面：优良细胞株的筛选、影响细胞生长及活性成分含量因素的探讨、诱导子的应用、活性成分的分离和化学分析、细胞培养物的药理药效学研究、生物反应器的研发以及发酵成本的降低等。对药用植物悬浮细胞培养来说，选择适宜培养基是植物细胞培养的首要条件，通过培养基中养分的调节可改变植物细胞生长及物质合成能力。在细胞培养过程中，除了物种本身特性外，还有环境中的许多物理因素，如光照、温度、pH值、电磁场等和化学因素，如培养基中碳氮磷源组成、溶氧、激素以及一些微量的金属离子等，对细胞生长和次生代谢产物的合成具有很大的影响。

高日等[10]通过研究人参细胞悬浮培养过程中培养基蔗糖浓度、MS浓度、氮浓度及硝态氮与铵态氮比例对细胞生长及皂苷合成的影响，发现在培养基中添加30 g·L-1蔗糖时，人参细胞合成皂苷能力最强，蔗糖浓度过低(10 g·L-1)或过高(70 g·L-1)均不利于细胞干重增加及皂苷积累。MS培养基浓度减半(0.5MS)或维持原浓度(1.0 MS)，总氮浓度为30 mm时，有利于人参细胞皂苷的合成。MS培养基中硝态氮促进皂苷合成，单独使用硝态氮(NO3+/NH4+30∶0)比与铵态氮混用或单独使用铵态氮(NO3+/NH4+为0∶30)更有利于皂苷的合成，皂苷生产量达到最高(158.9 mg·L-1)。有的学者对人参细胞悬浮培养中的激素调节及细胞分裂进行了相关研究，指出在人参细胞悬浮培养中，单独使用植物生长调节剂时2 mg·L-12,4-D和2 mg·L-1NAA的效果较好。在不同激素组合的试验中，以2 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1KT的效果最好[11]。

1990年，丁家宜等人首次研究了人参培养细胞的多糖类有效成分。袁静芳等[12]在人参细胞培养物中水溶性多糖的研究中，经醋酸纤维素薄膜电泳和琼脂糖凝胶电泳，证明DPSCG1和DPSCG2均为一性多糖，两者经水解和薄层层析结果均由L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸等组成，但两种多糖各有一个Rr值相同的未鉴定组成成分，有待进一步研究。

胡卓逸等[13]测定了不同培养期的人参细胞培养物(CMGC)中超氧化歧化酶(SOD)的活力，实验结果表明，不同培养期CMGC中SOD的活力不同，培养21 d的样品中单位鲜重酶活力单位和蛋白质含量均为最高。这些学者还测定了不同生长期的人参细胞培养物中过氧化氢酶的活力，结果表明此酶活力随人参细胞的培养时间而异，酶的单位鲜重活力从10 d到21 d内较快升高，在抽样测定中以21 d时为最高，约为188 μ·mg-1人参细胞培养物[14]。

人参细胞悬浮培养较固体培养周期短、生长速度快、皂苷含量比固体培养高都己得到了证实，这些特点也决定了其在工厂化生产上的潜力要大于固体培养。适合植物细胞培养的生物反应器的研发是实现植物细胞大规模培养的前提。目前应用于人参细胞培养生产人参皂苷的生物反应器主要有机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固体床生物反应器以及流化床生物反应器等[15]。为了更有利于人参细胞的培养，人们对现有反应器的搅拌形式、叶轮结构以及空气分布器进行了改进，力求在满足供氧、混合的要求的同时减小剪切力。

3 人参体细胞胚胎的研究

体细胞胚胎发生是单细胞或一群细胞被诱导不断再生非合子胚,并萌发形成完整植株的发育过程。在自然条件下,这个发育过程一般不可能发生,但通过组织培养,体细胞胚胎发育非常频繁,成为除器官发生以外再生完整植株的又一条途径。体细胞胚胎发生技术不仅是植物快繁的重要体细胞胚胎发生技术，而且也已发展成为研究植物胚胎发生机理遗传转化的重要方法，它在研究植物形态建成的分子和细胞机制等基础研究方面还是一个重要工具，在药用植物上的应用日益受到重视。

Monteiro M[16]在2001年的研究表明亚精氨在人参体细胞胚胎发生的起始阶段起到了特殊作用；Choi Y E等[17]的研究表明，在高浓度NH4NO3存在的条件下，可以通过从人参胎盘母面绒毛小叶诱导而来的人参愈伤组织来诱导形成非激素依赖型体细胞胚胎；Langhsová L等[18]的研究表明聚乙二酸和脱落酸能够促进人参体细胞胚胎的成熟和再生；Kim O T等[19]则对人参体细胞胚的培养条件进行了优化。人参体细胞胚胎的研究为人参再生植株的形成以及人参快速繁殖体系的建立提供了基础。我国学者比较了不同外植体、植物生长调节物质种类及配比对人参体细胞胚发生的影响，建立人参胚状体培养方法并获得再生植株[20-22]。

4 人参毛状根培养的研究

Inomata等[23]报道人参的毛状根培养没有一点延迟期，在培养的前两周生长很快，因此通过每七天更换一次培养基来保持毛状根的快速生长，培养32 d增长倍数达到31倍，是所有报道的人参培养物中增长倍数最高的，在此过程中，人参皂苷的含量呈现一定的变化，始终高于对照(不更换培养基的毛状根)，特别是第14天，总人参皂苷(Rg组，Rb组，Ro)含量达到1.7 %～2.2 %，相当于田间栽培5年生人参根中的皂苷含量水平。进一步在叶轮片式生物反应器(turbine-blade type bioreactor)中采用每7 d更换1次培养基的方法获得了与摇瓶中类似的结果，培养36 d，收获毛状根干重15.8 g·L-1，人参皂苷的含量1.7 %，这一结果表明该毛状根株系具有良好的开发应用前景。Jeong G T等[24]研究了SA(salicylic acid)、ASA(acetylsalicylic acid)、酵母、细菌、鞣酸、硒、硫酸镍以及氯化钠等诱导子对人参毛状根培养体系中人参皂苷产率的影响。研究表明绝大多数诱导子能够促进人参皂苷的积累但同时会在一定程度上抑制人参毛状根的生长。

近几年来，我国对人参毛状根的培养也有了一定进展。徐立新等[25]通过向人参毛状根培养基中添加2,4-D、NAA、IBA、诱导子MJA和SA，研究了5种外源物质对人参毛状根的生长量、总皂苷及单体皂苷Rb1的影响。结果表明，0.5 mg·L-1的IBA能显著促进人参毛状根的生长(月增长量为50.73 g·L-1)和总皂苷(质量分数为3.31 %)的积累，单体皂苷Rb1(质量分数为2.293 %)的含量明显增大，使其在总皂苷中所占的比例增大。并且两种诱导子对人参皂苷含量的增加有明显的协调作用，当MJA与SA浓度均为0.001 mmol·L-1时，其对总皂苷和单体皂苷的积累比二者单独作用要大。陈欣等[26]对人参毛状根糖基转移酶的分离纯化及酶学性质进行了相关研究，人参毛状根中提取分离了糖基转移酶，用SDS-PAGE测定其相对分子质量为56.6k，该酶以对羟基苯甲酸为底物时的Km= 0.399 nmol· L-1，Vmax= 2.74 nmol·min-1，反应的最适温度为45 ℃，最适pH值为8.0。

5 人参不定根培养的研究

不定根由于没有外源基因，在产品的开发方面更有优势，几年来越来越受到组织培养研究者的重视。人参不定根可以从体细胞胚胎进一步发育而形成的再生小植株上分离得到，也可以直接由人参愈伤组织诱导而来。由人参愈伤组织诱导不定根一般在MS培养基中添加适当种类和适当浓度的外源激素即可。常用来诱导人参不定根的激素为IBA(indole-3-butyric acid,IBA)。韩国在人参不定根培养的研究方面取得了重大突破，已经达到了工业化程度。Paek等[27]在大规模培养人参不定根生产皂苷的研究中，从人参不定根的诱导到悬浮细胞的建立，再进一步从培养条件，植物生长调节剂、诱导子、不同接种量和通气量等方面考察气升式生物反应器小规模培养到扩大培养的研究，然后中式规模生产，最后，人参不定根反应器培养的规模达到了10 t。Choi等[28]报道了利用5～500 L生物反应器规模化培养人参不定根的中试研究结果。

我国近年来也开始了人参不定根的组织培养研究。朴炫春等[29]报道了利用5 L气升式生物反应器培养人参不定根的生长周期，考察蔗糖浓度、接种量对人参不定根培养的影响，但未测定其皂苷的累积。黄滔等[30]对摇瓶培养人参不定根系统进行了优化。由香玲等[31]对小型生物反应器(3～10 L)培养人参不定根的生长和人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累积规律，以及蔗糖浓度、初始接种量对其生长和人参皂苷累积的影响进行研究。

6 展望

人参组织培养在细胞培养和不定根培养方面分别在日本和韩国实现了产业化，我国作为一个资源使用和出口大国，在注重人参大田栽培的同时，也应当在人参组织培养方面早日实现工业化，我们不能长久地靠砍伐山林来为世界提供廉价的人参资源，而应当在新技术的应用方面走在全国的前列。

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*高文远，E-mail: pharmgao@tju.edu.cn

2011-12-06)