动物基因定位的发展及其分子遗传标记

张建军 薛科邦 苟想珍 畴 鑫 谢文章

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃，平凉 744000；2.甘肃省华池县畜牧兽医站，甘肃，华池 745600；3.甘肃省环县畜禽改良站，甘肃，环县 745700）

近些年来，世界上的一些发达国家对动物基因定位的研究给予极大的重视，拨出较多的资金，开展了一系列较系统的研究，自中、美、日、德、法、英国科学家联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱，标志着生命科学又向纵深迈进了一步。同时，随着分子遗传标记技术的更加成熟，这一重大成果也使动物的基因定位研究进入了一个崭新发展的时期。

1 动物基因定位研究动态

动物基因定位研究被认为是未来动物分子育种的基石。由此，建立起来的DNA标记技术是未来动物育种的主要工具。动物基因定位的目标就是要在DNA水平上，确定控制经济重要性状座位。基因定位研究结果具有巨大的应用价值，国际著名数量遗传学家Soller估计基因定位技术可使奶牛年产奶量在短时间内增加3 000 kg；而英国著名遗传育种学家haley认为基因定位技术可在本世纪末使猪产仔数增加1头，其纯利对英国养猪业而言是7亿英镑。动物基因定位是未来动物品种改良的主要手段，特别是要在未来持续增加产量和改进质量以及迅速响应市场方面，只有分子育种才能快速做到，因此各个国家都将动物基因定位研究纳入国家重大优先研究项目。

欧洲猪基因定位计划（pig genome，project，pigmap）制定于1989年，并在1990年正式启动，有欧共体10个国家的16个实验室参加1993年，为了加强与美国和日本的竞争能力，欧洲Pigmap计划向其他非欧共体国家开放，参加的国家数增至14个，实验室数增至22个。Pigmap实施至今，发表了近500篇高水平论文，获得了28项专，带动了世界动物基因定位研究的发展。

美国是世界上开展动物基因定位研究最早的国家，但在1991年前都是些零散的研究活动。1991年美国农业部（USDA）同时资助启动了美国的猪、牛和鸡基因定位计划，即著名的“国家动物基因组研究计划”，由农业部直接领导，各个物种都成立了相应的协作委员会，各委员会又设1～2个著名科学家作为负责人。

我国动物生物技术研究与开发起步较晚，但在近年来却取得了很大的成绩，特别是在我国863计划的支持下，已逐步由单纯的模仿开始了自主创新，一批以动物生物技术为核心技术的企业也正在发展壮大。1999年我国有一定动物生物技术研究与开发规模的公司是21家，总产值不超过 8 500万人民币，然而政府与企业累计共同投入的研究与开发经费却达到1.6 亿人民币。主要资助和正在开展的研究有鹿、牛、黄鳝性别基因定位，家猪毛色基因定位，鸡性连锁矮小基因的定位，太湖猪高繁殖力基因的定位，猪、鸡数量性状的基因定位等。

2 DNA分子遗传标记

DNA 分子标记主要是指 DNA 水平上的变异。随着分子生物学的迅速发展，DNA 分子标记开始得到应用，通过测定遗传物质DNA 本身的变异，为遗传多样性检测提供一系列更加直接有效的途径，为基因的定位和改良提供了技术保障。基因定位技术主要是找到影响数量性状位点 （quantitative trait loci，QTL）中的主效基因，或与有连锁关系的DNA标记，通过标记辅助选择进行定向育种；基因改良是通转基因技术将产生特定性状的外源性基因导入到动物基因组上，从而达到改良重要生产性状或非常规性育种性状的目标。目前，在动物基因定位和改良上应用较广泛的分子遗传标记有限制性片段长度多态分析技术、随机引物扩增多态性DNA技术、扩增片段长度多态性分析技术和单核苷酸多态性标记等。

2.1 限制性片段长度多态标记（RFLP）

RFLP标记是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。其多态性产生的原因是DNA 某区域发生缺失、插入、突变引起酶切位点的消失、出现、位移或染色体重排引起电泳带改变。RFLP 的探针有 cDNA 探针和基因组 DNA 探针，前者有较强的保守性，可用于基因组比较和种群起源演化；后者检测的多态频率较高，但种属特异性强。RFLP标记的是单拷贝编码序列，大多数属单位点上的双位点基因，具有共显性特点，因此主要用于遗传连锁图的绘制和目的基因的标记。

2.2 随机扩增多态性标记（RAPD）

RAPD以基因组 DNA 为模板，利用非特异性寡核甘酸为引物（5～10 bp），通过DNA聚合酶链式反应扩增基因组。该类标记能检测到多个基因座位，多态信息含量变化范围大（0.2～0.9），可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下进行多态性分析。所用引物可人工合成，适用于生物界的不同物种。RAPD技术是在1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。RAPD标记比RFLP具有简便、快捷和多态性检出率高等特点，其主要应用于目标基因标记、遗传资源鉴定及分类。

2.3 扩增片段长度多态性（AFLP）

AFLP 的检测原理是使用双链人工接头与基因组DNA 酶切片段相连接作为扩增的模板，对酶切片段进行选择性扩增。由于不同来源的 DNA 酶切片段存在差异，导致产生的产物呈多态性。AFLP 实际是 RFLP 与PCR 相结合的一种技术，具多态性强，一般可检测 40～150 个扩增产物，非常适合绘制品种的指纹图谱及分类研究；稳定性好，重复性强以及样品适应性广等特点。

2.4 单核苷酸多态性（SNPS）

SNPS是1996 年美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的 E.S. Lander 提出的一类遗传标记系统。是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式，目前，SNP标记主要用于基因作图、人类疾病相关基因及药物设计研究等方面。随着分子标记技术与各种生物技术的结合，在对家畜重要经济性状遗传机理的分析、目的基因的筛选和定位，选择效率的提高、种质资源的保护研究和有效利用中，SNPs 标记技术将发挥巨大的作用。

2.5 单链构象多态性（SSCP）

SSCP其原理是单链 DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，相同长度的单链 DNA 当有一个碱基或者多个碱基发生改变时，就会影响其空间构象，使构象发生改变，在中性聚丙烯酰胺凝胶中其迁移率不一样，将不同迁移率的个体测序，可以非常准确地将构象上有差异的分子分别开来。单链构象多态性最初是1984 年由 Noumi 等对正常和突变的大肠杆菌 F1-ATPase 基因进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现的一种探测基因点突变的方法。1989 年，Orita将探针杂交和放射自显影技术应用到 SSCP 中。同年 Orita 等将 PCR 同 SSCP 相结合，使检测的灵敏度大大提高，并省去酶切等步骤，从而避免了先前采用基因组 DNA 特异性不强的缺陷。

3 展望

DNA分子标记的产生并应用于动物育种实践开创了动物基因定位和改良的新领域，大多数科学家和企业家都相信，动物基因定位研究将在21世纪形成低投入、高产出的巨大产业，是动物育种中最充满活力和前景最为灿烂的高新技术。在实际应用中将各种分子遗传标记相互结合，相互补充，可以从各个角度更深入全面地了解动物的本质，通过研究动物的遗传结构和控制机制，更好地揭示遗传结构和功能的内在联系，使动物定向培育的前景更加光明。

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