兔病毒性出血症病毒的分离与鉴定

马 越

（甘肃省玉门市畜牧兽医局，玉门 735211）

兔瘟又称兔病毒性出血症（RHD），是兔的一种以全身性出血和多发性血管内凝血为主要症状的急性、败血性、病毒性传染病。可通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径传染，潜伏期48～72 h。RHDV属杯状病毒科兔病毒属，其核衣壳仅有一种相对分子质量60 000的主要结构蛋白（Vp60）组成。病毒粒子在电镜下呈球形，20面体对称结构。能凝集人的O型红血球，对绵羊红血球有轻度凝集，不凝集其他动物的红血球[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

兔病毒性出血症病毒（RHDV），由甘肃农业大学兽医预防组提供。

1.1.2 试验动物

试验兔为甘肃省兰州市安宁区某农户家自养家兔，2个半月龄，未接种过疫苗，也未接触过感染源。

1.1.3 设备与试剂

离心机、混匀机、电镜、试管、烧杯、离心管、剪毛剪、5 ml注射器、手术刀、剪刀、灭菌棉、无菌手套、纱布、滤纸、镊子、照相机。生理盐水、双抗、PEG6000、NaCl、氯仿、PBS液。

1.2 方法

1.2.1 病料处理

将实验室病毒反复冻融3次，取2 ml装于离心管，标记为1号病毒，用于感染1号兔；然后再取8 ml组织研磨液4 ℃ 5 000 r/min 30 min，取上清2 ml，标记为2号病毒，用于感染2号兔。

1.2.2 动物接种

将2管RHDV分别接种2只敏感健康兔（2个半月龄家兔，未免疫，也未接触过病原），然后观察其临床症状及发病特征。

1.2.3 提取处理

1号兔于28 h左右死亡，2号兔约65 h左右死亡。将病死兔在实验室剖检，摘取有典型病变的内脏及器官，包括肝组织、脾组织、气管、肺组织、肾组织、心脏，然后加无菌生理盐水20 m1，研磨均匀后加入适量“双抗”，置4 ℃冰箱过夜，置-30 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 病毒提纯

1.2.4 .1 取病死兔的保存组织研磨液，以0.005M PBS液（含0.15M NaCI，pH7.4）制成1：10（W：V）的悬液，-20 ℃冻融3次。

1.2.4 .2 取适量病料，用4层纱布过滤，去除大杂质及组织，收集滤液。

1.2.4 .3 将滤液用滤纸再次过滤，再次收集滤液。

1.2.4 .4 将滤液1 000 rpm 离心30 min去除组织杂蛋白，收集离心上清液。

1.2.4 .5 在上清液中加入1/10体积的氯仿置于混匀机上混匀，然后放入4 ℃冰箱，作用30 min。

1.2.4 .6 将混匀液体5 000 rpm离心30 min，收集上层水相液，加入PEG6000及NaCl至终浓度6%和3%，振摇、使充分混合溶解，放置于4 ℃冰箱过夜。

1.2.4 .7 将过夜后的病毒液1O OOO rpm离心，30 min后弃上清。

1.2.4 .8 沉淀用适量的0.005M PBS液悬浮，加入1/10体积的氯仿置于混匀机上混匀，然后放入4 ℃冰箱，作用30 min。

1.2.4 .9 将混匀液体5 000 rpm离心30 min，收集上层水相液，即为提纯病毒液，-20℃冻存。

2 结果

2.1 临床症状

1号兔发病时，精神沉郁，完全拒食，不愿走动，并伴有全身抽搐症状，鼻孔冒出血性气泡。

2号兔发病时，采食减少甚至废绝，精神不振，被毛粗乱，迅速消瘦，结膜潮红，触摸耳部，有明显的发热现象，并伴有神经症状，尖叫抽搐而死，鼻孔有鲜血样泡沫流出。

2.2 剖检

发病兔鼻孔流出泡沫状的血液，肛门松弛，有少量淡黄色的粘性稀便，病死兔出现全身败血症变化，尸僵通常完好，但血液凝固不良。眼结膜充血，颜色紫红。2侧鼻孔有血性气泡或鲜血流出。口咽粘膜充血出血，气管粘膜充血潮红，且有出血点与出血斑，血液凝固不良。两侧肺脏膨大，颜色暗红，肺膜下有出血点或出血斑。肺切面暗红、湿润，稍压挤时有多量的血性液体流出。各肺叶均有广泛的出血点、出血斑或大片出血区域。

3 讨论与小结

3.1 发病情况分析

实验前，对实验室病毒未进行传代培养时，首次被感染兔未发病，其原因可能是被感染兔为市场出售的肉兔，接种了兔瘟疫苗，对病毒具有了较强的抵抗力；其次实验室病毒存放时间过长，毒力减弱，未能在兔体内大量增殖。但二次试验中，被感染兔分别在28 h左右和65 h左右发病死亡，而且病变特征明显，这是由于二次试验兔来自周边农户家，据了解未曾注射过兔瘟疫苗，也未接触过该病原，并且所感染的病毒为最近传代培养后提取的，毒力增强所致。

3.2 病毒提纯分析

有一部分离心管内的提纯病毒液颜色呈淡红色，可能是由于在提取过程中，有部分红细胞等杂质未能相对彻底的去除干净，但大部分病毒液颜色正常，为无色液体。

3.3 电镜观察分析

提纯后的病毒在电镜下观察时模糊不清，可能是由于未能将杂质相对彻底的去除所致。除此之外，试验过程中有些试验步骤受时间及条件限制未能连续进行，可能对试验结果也产生了一定影响。如果能将病毒进一步进行纯化，其效果可能会比较好。

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[2]盛祖恬，周明龙，杜青云，等.兔出血症病毒提纯和多肽的比较研究[J].畜牧兽医学报，1994，28（7），32～34

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[5]陈溥言主编.兽医传染病学[M].北京：中国农业出版社，2006

[6]陈杖榴主编.兽医药理学[M].北京：中国农业出版社，2001

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