线粒体与心肌缺血/再灌注损伤

李雪丽，刘建勋

(1.中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091;2.北京中医药大学，北京 100029)

心肌缺血/再灌注(ischaemia/reperfusion，I/R)可引起心肌代谢功能紊乱，并导致细胞严重受损甚至死亡，大量研究证明线粒体对该过程起重要的调控作用。I/R破坏线粒体稳态平衡进而引起结构和功能的改变是导致I/R损伤的关键因素，研究和阐明线粒体参与I/R损伤的机制，对心肌I/ R损伤线粒体保护新途径的发现和减轻I/R损伤，改善心梗患者的预后具有重要意义。

1 心肌缺血/再灌注导致的线粒体失衡

1.1 I/R损伤中线粒体ROS的大量生成 过去几十年，大量研究证明，心肌缺血时有少量活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，而再灌注初期会产生大量的ROS，线粒体不仅是ROS损伤的主要靶点更是ROS产生的主要位点。心肌细胞内，约0.2%～2.0%的分子氧通过复合物Ⅰ和复合物Ⅲ的电子传递生成超氧化物。缺血时产生的少量ROS可导致电子传递链的破坏并促进ROS的进一步产生;再灌注时氧浓度的瞬间增高加上高效的氧化磷酸化作用，促使线粒体ROS爆发性生成。通过抑制上游位点电子传递(尤其是复合物Ⅰ)或使用解偶联剂可减少I/R损伤，这种保护作用可能是通过减少线粒体ROS的产生实现的。

近年来，研究者提出了线粒体通过增加自身ROS对最初生成的ROS起正反馈作用的观点，被称作是ROS诱导的ROS释放(ROS-induced ROS release，RIRR)［1］，最初升高的ROS可诱导线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开启和线粒体去极化，从而产生源于线粒体电子传递链短暂的ROS爆发性生成，采用米酵菌酸抑制mPTP则能够同时抑制线粒体膜电位(△Ψm)的下降和第二阶段ROS的爆发性生成［1］;另外，Aon等［2］发现线粒体内膜阴离子通道(inner membrane anion channel，IMAC)与RIRR密切相关，IMAC抑制剂能够阻止ROS的爆发性生成，此外，该通道受线粒体苯二氮卓类受体(mitochondrial benzodiazepine receptor，mBzR)调节，mBzR拮抗剂也能够抑制RIRR。由RIRR途径产生的ROS可导致△Ψm下降和动作电位的稳定丧失，被认为是新发现的导致I/R损伤的重要介质。

1.2 线粒体钙稳态的失衡 线粒体对心肌细胞内Ca2+稳态的调节发挥关键作用，I/R所引起的线粒体功能障碍和线粒体Ca2+超载是导致心肌细胞死亡的重要原因。正常情况下，心肌细胞肌质网/内质网(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum，SR/ER)Ca2+释放位点附近分布有丰富的线粒体，可通过Ca2+单输送通道捕获大量的Ca2+，该转运机制仅通过△Ψm来驱动，不与其他离子交换或共转运。线粒体Ca2+浓度对细胞质Ca2+的迅速回应是通过Na+/Ca2+交换(Na+/ Ca2+exchanger，NCX)和H+/Ca2+交换(H+/Ca2+exchanger，HCX)实现的，二者分别通过Na2+和H+进入线粒体驱动Ca2+的排出，维持线粒体基质、细胞质和SR/ER的内钙稳态。然而，当单输送通道摄入的Ca2+浓度增加至NCX活力被饱和时，就会导致线粒体Ca2+超载。

研究证明，缺血时线粒体Ca2+浓度有少量升高，Griffihs等［3］观察到这可能与NCX逆转有关，采用Clonazepam(一种线粒体NCX抑制剂)可抑制缺血时线粒体Ca2+的增加;再灌注过程中线粒体Ca2+的浓度可升高4－5倍，而且这种高水平可以维持到再灌注后1h以上，这时再给予Clonazepam则增加线粒体Ca2+水平，这是因为氧的恢复使NCX的功能也逐渐恢复正常。目前研究认为，缺血时呼吸作用底物和氧利用受限造成的△Ψm下降、细胞质Ca2+浓度的升高以及mPTP的开启均会影响线粒体Ca2+平衡。Griffihs等［3］发现环孢素A(cyclosporin A，CsA)(一种mPTP抑制剂)可通过降低mPTP对Ca2+的敏感性对心肌细胞起保护作用，但Juhaszova等［4］的研究证明Ca2+浓度的增加并不能增强mPTP对ROS的敏感性。因此关于Ca2+介导心肌细胞mPTP开启作用的观点尚存在争议，需要进一步的体内实验来证实。

1.3 线粒体膜通透性改变

1.3.1 内膜通透性改变 线粒体内膜(inner mitochondrial membrane，IMM)通透性极低，几乎所有的离子甚至质子都不能通过，基质成分和代谢物必须在载体蛋白或高选择性通道的协助下才能实现跨膜运输，这种“不透性”对ATP的生成和△Ψm的维持起重要作用。关于内膜在线粒体膜通透性改变过程中的作用是有争议的［5－6］，但大多数研究认为这种作用是存在的，mPTP是内膜实现通透性转换的主要机制。mPTP是一种多蛋白复合体，主要由位于内膜的腺苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)、外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)和基质的亲环素D(cyclophilin D，Cyp-D)及细胞质的己糖激酶(hexokinase，HK)组成，所形成孔道具有电压依赖性和高传导性，全部开启时孔径为3 nm，可允许分子量小于1.5 kDa的物质被动扩散通过线粒体内膜。mPTP的不可逆高水平开放，直接导致△Ψm不可逆降低，氧化磷酸化解耦联，离子平衡失调，线粒体肿胀和ATP水解，最终导致细胞死亡［7］。

大量研究证明，心肌I/R可诱导mPTP开放，并且该现象更多发生于再灌注初期，因为该阶段线粒体ROS的爆发性生成、Ca2+迅速聚集以及pH值的逐渐升高均为mPTP的开放提供了最佳环境。mPTP的开放导致的IMM通透性增加及细胞色素C(cytochrome C，CytC)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等释放，介导了一系列细胞骨架、细胞膜及细胞核有关的蛋白质切割水解，若mPTP持续高水平开放则直接导致心肌细胞坏死;一定程度的开放和随后的及时关闭可致使细胞凋亡［7］。

1.3.2 外膜通透性改变 正常情况下，线粒体外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)对膜间隙蛋白是不通透的，通过检测典型膜间隙蛋白(如CytC，AIF)的亚细胞定位，可间接反应OMM的通透性变化。进一步的研究表明［8－10］，当OMM通透性增加时，procaspases、Smac/Diablo、Omi/Htr2A和EndoG等关键性蛋白也被释放到细胞质并转移到核内或与内质网上的受体相互作用，通过多种途径参与调节细胞的死亡过程，其中包括caspase的激活，代谢改变，氧化磷酸化破坏，非caspase依赖性的细胞凋亡等。CytC是最常见的线粒体释放蛋白之一，可与Apaf-1、dATP及caspase-9结合成凋亡复合体，激活caspase-9及下游效应物，最终导致细胞死亡。AIF是非caspase依赖性效应物，释放后快速转移至细胞核使染色质凝聚和DNA片段化，有研究报道［11］在I/R心肌细胞核碎片和胞质中检测到了AIF，缺血预处理可减弱AIF的释放。Bahi等［12］发现缺血可诱导心肌细胞线粒体EndoG的释放及核转移，用特异性siRNA置换EndoG可减少DNA片段化，但也有研究显示EndoG缺失的小鼠其细胞死亡和DNA断裂没有明显变化［13］，从这些小鼠分离到的细胞对各种凋亡刺激的易感性没有明显差异［14］。因此，EndoG在I/R心肌细胞凋亡中的作用还需要深入的研究。

1.4 线粒体形态的改变 近年来，随着荧光成像和三维成像技术的发展，对线粒体形态的认识也更加深入。线粒体的管网状组织是高度动态化的，通过持续的、相对独立的分裂和融合事件维持的动态平衡对应答细胞不同生理需求具有非常重要的意义。

最近的研究证明，心肌I/R损伤与线粒体的形态变化相关，I/R过程中线粒体分裂融合的动态平衡被破坏，线粒体趋向于分裂并发生片段化。Brady等［15］对培养的HL-1细胞模拟缺血刺激，结果发现严重的线粒体片段化，复氧时也发生同样变化，并证明片段化的发生与发动蛋白相关蛋白1 (dynamin-related protein-1，Drp1)的活化和线粒体转移相关，给予SB203580(p38MAPK药理抑制剂)可使线粒体再融合和恢复管网状结构。目前，缺血诱导的细胞线粒体片段化机制还不清楚，可能与细胞钙超载、ROS的产生和mPTP的开放有关。Plotnikov等［16］采用抗氧化剂能够抑制缺血诱导的线粒体分裂。Hom等［17］发现毒胡萝卜内酯(内质网Ca2+摄取抑制剂)或KCl引起的细胞钙超载可促进心肌细胞线粒体分裂增加。Cereghetti［18］和 Han等［19］进一步研究显示细胞内钙超载可分别通过激活磷酸酶、钙神经素或激活Ca2+/ CaMKIα途径使Drp1去磷酸化而活化并转移到线粒体诱导线粒体分裂。此外，也有研究证明［20］，mPTP的开放可能导致Drp1介导的线粒体分裂，相反抑制线粒体分裂或促进线粒体融合的同时mPTP的开放程度减弱，因此认为该机制也参与了I/R心肌保护作用。

线粒体的分裂、融合过程受多种蛋白的精确调控，Mfn1和Mfn2是参与线粒体外膜融合的关键蛋白，内膜的融合主要是由Dynamin家族蛋白Mgmlp/OPA1介导，Drp1/Dnmlp、Fisl/Fislp、Caf4p和Mdvlp参与线粒体分裂的调控。目前，抑制I/R过程中线粒体片段化的新策略之一是通过干预关键蛋白的表达。Ong等［20］用线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2及Drp1K38A(Drp1的显性突变结构)转染HL-1细胞，结果显示管网状形态的线粒体有所增加，细胞I/R损伤减弱;Chen等［21］研究发现，缺血诱导的心肌H9c2细胞线粒体分裂与线粒体融合蛋白OPA1的水平降低有关，但OPA1的过表达却不能保护缺血诱导的细胞凋亡。

目前，线粒体形态变化与疾病发生相关性的研究仍是热点，深入阐明线粒体分裂与I/R过程中钙超载、ROS产生及mPTP的开放之间的相互作用，将为心肌I/R损伤的防治提供新的途径。

2 线粒体在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用

2.1 线粒体ATP敏感性钾通道的保护作用 线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K+，mKATP)的生理作用是一方面维持线粒体内K+平衡，从而控制线粒体基质容积的改变;另一方面通过K+的再摄取部分补偿质子泵产生的电荷转移，从而维持跨膜电位差和pH梯度的稳态。大量研究认为，mKATP开放具有心肌保护作用，mKATP开放剂可模拟缺血预处理的心肌保护效应，相反给予阻断剂保护作用减弱或消失。据报道，mKATP的开放可减少线粒体Ca2+的摄入和mPTP的开放［22］，也能够增加电子传递链ROS的产生(短暂缺血和再灌注时产生的低水平的ROS被认为在IPC中起重要作用)［23－24］。此外，mKATP开放后，K+内流线粒体内渗透压升高，基质容积增加，并直接影响能量代谢，促进ATP的生成，这一过程对I/R过程中细胞的自身保护也起到积极作用。

2.2 线粒体通透性转换孔的保护作用 目前，mPTP被认为是防治心肌I/R损伤的重要靶点，大量实验证明，通过直接干预孔道组成成分或间接减少孔道开启诱因(如ROS、Ca2+和pH)，抑制mPTP的开启，对心肌I/R损伤具有明显的保护作用［25－26］。

Cyp-D是mPTP的主要成分，对mPTP的开放起关键调控作用，缺失Cyp-D的小鼠对Ca2+和氧化应激诱导的mPTP开放更具有抵抗力，I/R损伤也有所减少［27］。CsA是Cyp-D抑制剂，研究表明CsA对心肌I/R损伤具有同样的保护作用，可减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞死亡［28］，减小I/R心肌梗死面积［29］。研究证实，IPC的保护作用与其抑制再灌注初期mPTP的开放密切相关。Javadov等［25］采用3H-DOG技术，证明了IPC能够抑制再灌注初期mPTP的开放，并促进其随后的关闭。目前，mPTP的结构成分尚未完全确定，对其结构和功能的深入研究将有利于阐明mPTP参与I/R损伤的作用机制和新靶点发现。

3 展望

综上所述，线粒体的完整性对心肌细胞的存活至关重要。心肌I/R过程使线粒体各种稳态平衡均发生严重改变，并且这些因素相互影响，形成恶性循环，从多种途径参与了心肌I/R损伤的发生。目前，mKATP和mPTP作为心肌I/R损伤线粒体保护途径的重要靶点已被广泛研究，并显示良好的心肌保护作用。线粒体RIRR途径产生的ROS、膜通透性的改变以及线粒体形态的改变是近年来发现的参与心肌I/ R损伤的重要机制，抑制或减小这些改变均能改善心肌I/R损伤。随着研究的深入和I/R损伤线粒体机制的进一步阐明，直接或间接保护线粒体完整性，维持和控制线粒体稳态平衡，增强线粒体的缺血耐受性必将成为防治心肌I/R损伤的重要策略。

［1］ Zorov D B，Filburn C R，Klotz L O，et al.Reactive oxygen species(ROS-induced)ROS release:a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes［J］.Exp Med，2000，192:1001－14.

［2］ Aon M A，Cortassa S，Marban E，O'Rourke B.Synchronized whole cell oscillations in mitochondrial metabolism triggered by a local release of reactive oxygen species in cardiac myocytes［J］.Biol Chem，2003，278:44735－44.

［3］ Griffiths E J，Ocampo C J，Savage J S，et al.Mitochondrial calcium transporting pathways during hypoxia and reoxygenation in single rat cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，1998，39:423－33.

［4］ Juhaszova M，Zorov D B，Kim S H，et al.Glycogen synthase kinase-3beta mediates convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition pore［J］.Clin Invest，2004，113(11):1535－49.

［5］ Green D R，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］.Science，2004，305:626－9.

［6］ Kroemer G，Martin S J.Caspase-independent cell death［J］.Nat Med，2005，11:725－30.

［7］ Zamzami N，Larochette N，Kroemer G.Mitochondrial permeability transition in apoptosis and necrosis［J］.Cell Death Differ，2005，12:1478－80.

［8］ Adrain C，Creagh E M，Martin S J.Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2［J］.EMBO，2001，20:6627－36.

［9］ Patterson S D，Spahr C S，Daugas E，et al.Mass spectrometric identification of proteins released from mitochondria undergoing permeability transition［J］.Cell Death Differ，2000，7(2):137－44.

［10］Saelens X，Festjens N，Walle L V，et al.Toxic proteins released from mitochondria in cell death［J］.Oncogene，2004，23:2861－74.

［11］Kim G T，Chun Y S，Park J W，Kim M S.Role of apoptosis-inducing factor in myocardial cell death by ischemia-reperfusion［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，309(3):619－24.

［12］Bahi N，Zhang J，Llovera M，et al.Switch from caspase-dependent to caspase-independent death during heart development:essential role of endonuclease G in ischemia-induced DNA processing of differentiated cardiomyocytes［J］.Biol Chem，2006，281:22943－52.

［13］Irvine R A，Adachi N，Shibata D K，et al.Generation and characterization of endonuclease G null mice［J］.Mol Cell Biol，2005，25(1):294－302.

［14］David K K，Sasaki M，Yu S W，et al.EndoG is dispensable in embryogenesis and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2006，13: 1147－55.

［15］Brady N R，Hamacher-Brady A，Gottlieb R A.Proapoptotic BCL-2 family members and mitochondrial dysfunction during ischemia/ reperfusion injury，a study employing cardiac HL-1 cells and GFP biosensors［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757(5－6):667－78.

［16］Plotnikov E Y，Vasileva A K，Arkhangelskaya A A，et al.Interrelations of mitochondrial fragmentation and cell death under ischemia/reoxygenation and UV-irradiation:protective effects of SkQ1，lithium ions and insulin［J］.FEBS Lett，2008，582(20):3117－24.

［17］Hom J，Yu T，Yoon Y，et al.Regulation of mitochondrial fission by intracellular Ca2+in rat ventricular myocytes［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1797(6－7):913－21.

［18］Cereghetti G M，Stangherlin A，Brito O M，et al.Dephosphorylation by calcineurin regulates translocation of Drp1 to mitochondria［J］.Proc Natl Acad Sci，2008，105(14):15803－08.

［19］Han X J，Lu Y F，Li S A，et al.CaM kinase Iα-induced phosphorylation of Drp1 regulates mitochondrial morphology［J］.Cell Biol，2008，182(3):573－85.

［20］Ong S B，Subrayan S，Lim S Y，et al.Inhibiting mitochondrial fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury［J］.Circulation，2010，121:2012－22.

［21］Chen L，Gong Q，Stice J P，Knowlton A A.Mitochondrial OPA1，apoptosis，and heart failure［J］.Cardiovasc Res，2009，84(1): 91－9.

［22］Holmuhamedov E L，Wang L，Terzic A.ATP-sensitive K+channel openers prevent Ca2+overload in rat cardiac mitochondria［J］.Physiol，1999，519:347－60.

［23］Pain T，Yang X M，Critz S D，et al.Opening of mitochondrial KATP channels triggers the preconditioned state by generating free radicals［J］.Circ Res，2000，87:460－6.

［24］Otani H.Reactive oxygen species as mediators of signal transduction in ischemic preconditioning［J］.Antioxid Redox Signal，2004，6(2):449－69.

［25］Javadov S A，Clarke S，Das M，et al.Ischaemic preconditioning inhibits opening of mitochondrial permeability transition pores in the reperfused rat heart［J］.Physiol，2003，549(2):513－24.

［26］Argaud L，Gateau-Roesch O，Muntean D，et al.Specific inhibition of the mitochondrial permeability transition prevents lethal reperfusion injury［J］.Mol Cell Cardiol，2005，38(2):367－74.

［27］Nakagawa T，Shimizu S，Watanabe T，et al.Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death［J］.Nature，2005，434:652－8.

［28］Nazareth W，Yafei N，Crompton M.Inhibition of anoxia-induced injury in heart myocytes by cyclosporin A［J］.Mol Cell Cardiol，1991，23(12):1351－4.

［29］Griffiths E J，Halestrap A P.Protection by Cyclosporin A of ischemia/reperfusion-induced damage in isolated rat hearts［J］.Mol Cell Cardiol，1993，25(12):1461－9.