补体旁路激活对内皮细胞纤溶功能的影响

蒿雨露，孙黔云，李 敏

(1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025;2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550007; 3.贵州省人民医院呼吸疾病研究所，贵州贵阳 550002)

补体对机体防御和免疫功能有重要的作用，然而其过度激活会造成炎症和损伤［1］。旁路激活是补体激活的一条重要途径，很多疾病的发生与补体的旁路激活密切相关［2］。激活的补体会对内皮细胞产生作用和影响。内皮细胞具有多种重要的分泌调节功能，而补体旁路激活对内皮细胞纤溶功能影响的研究极少见报道。为进一步探讨炎症相关病征中补体激活与凝血功能异常的相关性，本文开展了补体旁路激活对内皮细胞纤溶功能影响的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人微血管内皮细胞株(HMEC)由本实验室传代培养。眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的分离制备和激活补体旁路的活力单位测定同文献［3］。健康人混合血清(normal human serum，NHS)由本实验室健康志愿者献血制备。灭活人血清(inactivated normal human serum，INHS)为正常人血清56℃处理30 min而得。将NHS与CVF(6.5× 104U·L－1)等体积混合，37℃孵育30 min，获得补体旁路充分活化的血清。tPA、PAI-1含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活化血清对内皮细胞分泌tPA、PAI-1的影响 取对数期生长的HMEC细胞以1×104cells·well－1接种，培养24 h后弃上清，正常对照组加入200 μl正常培养基，刺激组加入60 μl激活血清孵育物，灭活血清组加入与刺激组等量的灭活人血清，均用正常培养基补足至200 μl。37℃分别培养1、6、12、24 h。取上清测定tPA和PAI-1含量。

1.2.2 活化血清对内皮细胞纤溶功能影响的分析 以tPA/PAI-1表示HMEC纤溶功能变化。

进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 补体激活对内皮细胞分泌tPA、PAI-1的影响 检测结果表明，HMEC经活化的血清刺激后，tPA、PAI-1的表达与正常对照组相比有不同程度的增加。其中，1 h时，刺激组、正常对照组、灭活血清组tPA含量分别是(3.82±0.86)、(0.21 ±0.36)、(1.78±1.58)μg·L－1，3组的 PAI-1分别为(46.65±18.82)、(16.97±17.24)、(63.17±27.23)μg· L－1。1 h刺激组tPA含量与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，而刺激组PAI-1含量在1 h时和正常对照组相比，差异无统计学意义，在6、12、24 h与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 补体激活对内皮细胞纤溶功能的影响情况 tPA/PAI-1表明在1 h时间点刺激组内皮细胞的纤溶功能明显上调，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，而在6、12、24 h时间点时，其纤溶功能低于正常对照组。

3 讨论

CVF是一种能特异激活血清补体旁路途径的蛇毒蛋白，其激活补体旁路的产物与生理或病理条件下补体旁路激活的产物完全一致。本工作采用CVF充分活化的血清作用于内皮细胞，观察补体旁路激活对内皮细胞纤溶功能的影响。

本文的结果显示正常培养的HMEC具有分泌tPA和PAI-1的功能。HMEC经活化血清作用后，在早期会出现内皮细胞tPA/PAI-1的明显上调，表明纤溶功能明显增强，随后下调至低于正常水平。有研究报道人脐静脉内皮细胞经补体旁路激活刺激后，纤溶功能下降［4］，与我们的实验结果不相吻合。这种差异可能与内皮细胞的来源不同有关，也可能与实验中检测时间点的设置有关。

补体过度激活与炎症的发生发展密切相关，诸如败血症、多器官功能衰竭等炎症引发的病征均伴随有凝血功能的异常以及广泛的微血栓生成［5］，提示凝血系统功能异常与炎症的发生有关。本实验结果表明补体旁路激活会导致内皮细胞纤溶功能下降，提示在炎症相关疾病和病征中，凝血系统功能的异常可能与补体旁路激活所引发的内皮细胞纤溶功能下降有密切关系。

［1］ Sarma J V，Ward P A.The complement system［J］.Cell Tissue Res，2011，343(1):227－35.

［2］ Harboe M，Mollnes T E.The alternative complement pathway revisited［J］.J Cell Mol Med，2008，12(4):1074－84.

［3］ 孙黔云，叶巧玲，闫银萍.小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法［J］.中国药理学通报，2011，27(11):1619－22.

［3］ Sun Q Y，Ye Q L，Yan Y P.A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1619－22.

［4］ 桂军胜，黄守坚，刘 青.眼镜蛇毒因子引起内皮细胞损伤［J］.中国药理学通报，2000，16(6):635－8.

［4］ Gui J S，Huang S J，Liu Q.Cobra venom factor induces injury of cultured endothelial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2000，16 (6):635－8.

［5］ Levi M，van der Poll T.Inflammation and coagulation［J］.Crit Care Med，2010，38(2 suppl):S26－34.