蛋白磷酸酶1与Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究进展

廖儒佳，曹雯雯，张 伟

(南通大学医学院，江苏南通 226001)

心肌疾病是指除心脏瓣膜病、冠状动脉粥样硬化性心肌病、高血压心脏病、肺源性心肌病、先天性心血管病和甲状腺功能亢进性心肌病等以外的以心肌病变为主要表现的一组疾病，症状常表现为心力衰竭。1995年世界卫生组织和国际心脏病学会(WHO/ISFC)工作组根据病理生理学将心肌病分为四型，即扩张型心肌病(dilated crdiomyopathy，DCM)、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)、限制型心肌病(restrictive cardiomyopathy，RCM)及致心律失常型右室心肌病(arryhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)。但不定型的心肌病(unclassified cardiomyopathies，UCM)仍保留。随着研究的发展此分类已显示出很多缺陷，2006年美国心脏病学会新定义心肌病为由各种病因主要是遗传因素引起的一组非均质的心肌病变，包括心脏机械和电活动的异常。心肌病可以单纯局限于心脏，也可以是全身系统性疾病的一部分，最终导致心力衰竭或死亡［1］。

目前心肌病的分子和细胞生物学研究取得了较大进展。研究发现DCM由心肌结构蛋白如肌动蛋白、α-原肌球蛋白等突变所致，采用候选基因筛查和连锁分析策略已定位26个染色体位点与该病相关，并已从中成功鉴定出22个致病基因［2］。HCM是由多种编码心肌肌小节的收缩蛋白质基因突变引起的，已将其致病基因定位在9个不同的染色体上，至少15种HCM致病相关基因及450种以上致病性基因突变，且已确认11种基因突变与该病有关［2］。RCM较少见，有报道肌钙蛋白I的突变可引起限制性及肥厚型心肌病［3］。目前ARVC的研究认为其系第8号染色体上4个基因突变所致，分别是兰尼碱受体(Ryanodine receptor，RyR)、代司莫普拉肯、Plakophillin-2和转录生长因子-β调节基因［2］。

1 PP1的相关研究

目前研究显示蛋白磷酸酶家族包含 PP1、PP2A、PP3 (PP2B/calcineurin)、PP4、PP5、PP6与PP7，而PP1、PP2A和PP3是研究最深入的3种蛋白磷酸酶，其中PP1与PP2A是许多细胞内最丰富的蛋白磷酸酶，尤其PP1在心肌细胞肥厚与心力衰竭的病理生理中发挥极其重要的作用［4］，已发现终末期心力衰竭病人的PP1表达明显增加［5］，而其内源性抑制剂及其下游的调控蛋白的表达明显下降［6］。PP1(35-38 ku)是最保守的真核生物蛋白质之一，其作为一种重要的蛋白磷酸酶参与细胞许多重要生理功能，包括转录、翻译、代谢、调控Ca2+-ATPase活性等。

1.1 PP1的结构与分布 真核生物基因组有1～8个基因是编码PP1，哺乳动物有3个PP1基因，分别编码PP1α，PP1γ和 PP1β/δ亚型，这些亚型被广泛表达且它们约有0.89的相似氨基酸序列，这些亚型主要不同之处是其N端与C端［7-8］。1995年Goldberg等［9］首次报道了PP1催化亚基的三维结构，从分子水平上看，其全酶由1个固定的催化亚基(具有磷酸化的活性)和估计多达100个调控亚基组成的异二聚体。1997年Egloff等［10］研究了PP1γ的晶体结构，发现其催化亚基环绕周围形成3个凹槽，分别为:酸性凹槽(acidic groove)、疏水凹槽(hydrophobic groove)和C端凹槽(C-terminal groove)。3个凹槽形成Y字型结构，其两臂之间夹着一个重要的结构区，即β12/β13 loop，该环是同族丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的共有结构，研究表明该区域为抑制剂结合区。从细胞水平上看、PP1α在细胞质与细胞核均有分布，且聚集于未知核小体中，PP1γ在细胞质与细胞核均有分布，且聚集于核仁中，PP1β/δ则在细胞核与细胞质中均广泛分布［11］。从组织水平上看，PP1α、PP1γ和PP1β/δ在哺乳动物组织中广泛分布于脑、肝、骨骼肌、肾、小肠、心脏、肺等，其中PP1α除在心脏和骨骼肌的表达水平太低无法检测外，在其它组织均有分布;PP1γ则在脑、小肠和肺中表达最高;PP1β/δ除在骨骼肌的表达水平太低无法检测外在其它组织也有分布［12］。值得注意的是PP1α与PP1γ在心脏中的表达极低，而 PP1β/δ表达则相对较高，因此可以推测PP1β/δ亚型在心肌疾病的发生与发展中可能起重要作用。事实上3种亚型中目前发现只有PP1β/δ在心衰的心脏中表达明显升高，且其主要是通过调控肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)中受磷蛋白(phospholamban，PLN)的丝氨酸16位磷酸化调节心肌细胞Ca2+，参与调节心肌细胞功能［13］。研究显示心肌组织特异性的过表达PP1β/δ shRNA，抑制PP1β/δ的表达，能明显改善心衰心脏中SR中Ca2+稳态平衡［14］。

1.2 PP1与心肌病 PP1是心脏功能重要的负调控蛋白，在心脏中PP1作为主要的磷酸酶负责SR中PLN去磷酸化，而PLN主要参与SR中Ca2+-ATPase活性的调控，PLN在去磷酸化状态能抑制Ca2+-ATPase活性，PLN偶联β肾上腺素受体磷酸化其蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的丝氨酸16和CaMKⅡ上的苏氨酸17位点能减轻其抑制作用，进而增加Ca2+进入SR的量，增加心肌收缩力［15］。已发现PP1的活性在心衰病人中增加导致PLN磷酸化减少，因此减少了Ca2+-ATPase的活性，并抑制了PLN诱导SR中Ca2+转运的功能，从而影响心肌细胞功能;有趣的是，RyR在心衰病人心脏中高度磷酸化，从而导致Ca2+依赖的活性增加并进一步减少SR中Ca2+负荷。因此，心肌细胞SR中PLN磷酸化的减少与RyR磷酸化程度增加这个自相矛盾的两方面可能反映了激酶与磷酸酶在微环境中的复杂作用，也反映了PP1在心脏中复杂的调控作用［4］。

一组研究通过小鼠模型证实心脏中过度表达PP1(3倍)导致心脏收缩功能减弱，引起扩张型心肌病和过早死亡［15］，而过表达PP1抑制剂1和2(inhibitor 1 or 2 of protein phosphatase 1，Inh-1，Inh-2)均能有效地抑制心肌肥厚和心衰的发生/发展，并可以逆转由于PP1过表达引起的心肌肥厚和心功能缺失［16-20］。Rajashree等［21］发现PP1通过磷酸化心肌细胞的肌球蛋白轻链2潜在的引起心肌等长张力增加0.2～0.3，而过度磷酸化导致心肌肥厚。Singh等［22］发现蛋白激酶 A固着蛋白(A-kinase anchoring protein 18，AKAP18)通过直接影响Inh-1调节PP1的活性参与调控心肌功能。而有研究认为热休克蛋白20(small heat shock protein 20，HSP20)增强心肌基础功能的主要原因在其能抑制PP1活性［23］。因此越来越多的证据表明设法抑制PP1活性已成为心肌病的潜在治疗方案。然而目前对这一观点还存在部分疑问。Grote-Wessels等［24］就报道了过表达Inh-2并没有使小鼠心功能在压力过负荷诱导的心肌肥厚中发生改善，事实上Inh-2过表达反而加速了心功能恶化。作者推测这是因为长期过表达Inh-2而长期抑制PP1活性，导致机体出现负反馈调节，而恶化心功能。因此考虑到PP1是一种在整个机体中作用广泛的蛋白，短期抑制PP1活性，不管是通过表达其内源性抑制蛋白Inh-1与Inh-2或应用外源性抑制剂如tautomycetin都能改善心功能，但如果长期维持势必对心功能产生不良影响。但什么情况下长期表达、什么时候用短期治疗，这个度怎么判断，目前来看还是一个问题。其次为什么长期表达会发生PP1的负反馈调节，它的调控机制是什么，也是未来值得研究的方向。此外由于外源性的PP1阻断剂能同时阻断蛋白磷酸酶2A(PP2A，一种同族的蛋白去磷酸化酶，调节心肌细胞收缩性)活性，并导致细胞死亡，因此开发PP1特异性抑制药，也成为未来研究的焦点。

2 CaMKⅡ的相关研究

目前Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶家族(Ca2+/calmodullin-dependent protein kinase，CaM Kinase)包括 CaMKⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅢ和CaMKⅣ。除CaMKⅢ主要调控延胡索酸2外，其余3种Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶均是多功能蛋白激酶。CaMKⅠ是一种单体酶，主要位于细胞质，但其C末端截断形式也能转位到细胞核磷酸化并激活一系列的转录因子的表达。目前发现其在心脏组织也有表达，但在心肌肥厚的病理变化中却并没有发现增加，因此其在心肌疾病中的作用还有待进一步研究。CaMKⅣ也是一种单体酶，目前发现其主要分布于神经元、T淋巴细胞及睾丸，在心脏中还没有检测到。CaMKⅣ主要位于细胞核中在转录调控及基因表达中起重要作用。CaMKⅡ(-600 KD)是一种同源或异源的多体酶，广泛分布于哺乳动物的心脏、骨骼肌、肺、肝脏、胰腺、视网膜、肾、甲状旁腺、乳腺、子宫等。研究显示CaMKⅡ作为一种重要的蛋白激酶主要参与与Ca2+信号有关的细胞功能调控，包括氨基酸和脂质代谢、离子通道/受体及神经递质的合成与释放、转录因子、翻译因子、细胞骨架蛋白和Ca2+平衡等。它是心脏中最主要的CaM Kinase亚型，CaMKⅡ在心脏中发挥了极其重要的功能，特异性过表达CaMKⅡ在心脏中或离体心肌细胞中均能明显调控兴奋收缩耦联作用［25］。

2.1 CaMKⅡ的结构和分布 CaMKⅡ全酶由3个关键区域组成的亚单位构成，这3个区域分别是:连接区-与复合体直接相连;调控区-控制酶的活性和自动抑制作用;催化区-行使CaMKⅡ功能。目前研究发现CaMKⅡ有超过30个由可变剪接产生的亚型，但其在心脏中研究最广泛的是分别由4种不同的基因(α、β、γ、δ)编码的亚型，并且目前发现很多可变剪接产生的亚型都可归入这4种亚型细分亚型。神经组织中主要表达CaMKⅡα和CaMKⅡβ，啮齿类海马中CaMKⅡα和CaMKⅡβ占到总蛋白量的0.2。CaMKⅡγ和CaMKⅡδ则几乎在机体的所有组织中表达。目前发现哺乳动物心脏中主要是CaMKⅡδ亚型，并且主要是CaMKⅡδA、 CaMKⅡδB、CaMKⅡδC 3种，这3种亚型由于其结构与细胞定位不同而发挥不同功能。其中CaMKⅡδB的可变区1中包含一个由11个氨基酸组成的核定位信号，因此主要位于细胞核，其主要涉及心钠素(atrial natriuretic factor，ANF)基因表达的调控，且它似乎也是成人心脏中最主要的CaMKⅡ亚型。而CaMKⅡδC由于缺乏核定位信号而主要位于细胞质中。CaMKⅡδB在心肌肥大基因的表达中具有重要作用，在心脏及心肌细胞中过表达CaMKⅡδB能保护心脏免受缺血再灌注诱导的损伤［26］，且在CaMKⅡδB转基因小鼠中，CaMKⅡδB的过表达促进心肌肥厚基因的表达，如myocyte enhancer factors(MEF2)和 histone deacetylase 4(HDAC4)等，最终引起心肌肥厚和心力衰竭［27-28］。CaMKⅡδC通过磷酸化一系列Ca2+调控蛋白而影响兴奋收缩偶联，在CaMKⅡδC转基因小鼠中，因CaMKⅡδC过度表达激活胞质内的RyR2，使得Ca2+过度释放，而导致心脏电-机械活动异常，心肌过度肥厚，并造成扩张性心肌病和心力衰竭，且过表达CaMKⅡδC会诱导心肌细胞凋亡［29］。CaMKⅡδA不含核定位信号，主要分布在心脏细胞T管区，最初发现在神经元表达［30］，后发现主要表达于新生心肌细胞，且一个月后其表达逐渐消失［31］。研究发现转基因小鼠中过表达CaMKⅡδA能增强兴奋收缩偶联引起的心肌过度收缩而诱导心衰，此外，其活性上调伴随着心肌细胞增大，肌原纤维重构且激活一系列心肌肥大基因如ANF及肌球蛋白重链［27，32］。

2.2 CaMKⅡ与心肌病 心脏组织主要表达CaMKⅡδ亚型，分布在心肌细胞T管终未池、肌浆网、内质网和细胞核等，通过磷酸化数种Ca2+调节蛋白，如RyR、phospholamban、L-型钙通道、肌浆网Ca2+-ATP酶等调节心肌细胞电兴奋收缩偶联。另外，CaMKⅡδ也参与基因表达长期调节(电兴奋-转录调控)，而参与各种内外源性刺激引起的心脏细胞肥大性生长，肌节结构重组及胚胎基因表达，最终引起心肌肥厚而导致心力衰竭。CaMKⅡδ过度激活导致心肌细胞RyR2功能异常，引起静息状态下细胞中Ca2+通过RyR从SR漏出到细胞质内，使Ca2+浓度升高，SR钙储备量下降，使心脏收缩时从SR释放的Ca2+减少，而影响心肌收缩力，并相应增加心脏舒张时SR的Ca2+量，易导致延迟后去极化等心率失常发生。CaMKⅡ的激活还伴随着细胞内氧化态改变，并上调与CaMKⅡ有关的组成性激活突变基因酶，此类酶参与心肌病中多个病理通路包括激活一类影响心肌细胞兴奋收缩偶联及细胞生存的酶如离子通道、调控Ca2+稳态的蛋白及与炎症基因表达有关的转录因子等［33-34］。

无论在多种原因引起的终末期心肌病病人，还是在结构性心肌病的动物模型心脏中，CaMKⅡδ蛋白含量和活性均升高，而选择性地抑制心脏CaMKⅡδ则减轻多种模型心肌病变和心力失常，改善心肌收缩。Zhang等［35］通过应用小鼠心肌CaMKⅡδ抑制模型证实抑制CaMKⅡδ能够极大地阻止βAR过度表达和心肌梗死。Satoru等［36］发现过表达CaMKⅡ影响了一系列钙调控蛋白导致Ca2+稳态被破坏进而增加活性氧的量。Respress等［37］发现在心衰的病人及小鼠模型中CaMKⅡ主要磷酸化RyR2丝氨酸2814位点进而导致Ca2+稳态失衡。CaMKⅡ磷酸化RyR2导致心衰的发展还跟心衰的类型有关系，只有在非局部缺血导致的心衰病人或压力过负荷诱导的心衰中CaMKⅡ磷酸化RyR2调控Ca2+的稳态，且选择性敲除RyR2的丝氨酸2814位点明显延缓心衰的进程。与此相反，局部缺血导致的心衰病人或急性心肌梗死小鼠模型中却并没有观察到这种现象。因此，CaMKⅡδ的激活在心肌肥厚和重构中起重要作用，它可能成为临床治疗心肌肥厚和心力衰竭的重要靶蛋白。因此抑制CaMKⅡδ的过度激活已经成为心肌病潜在的治疗靶点。但目前关于β-肾上腺素是否直接激活CaMKⅡδ还不清楚，目前只观察到部分β-肾上腺素对兴奋收缩偶联的作用由CaMKⅡδ调控，且虽然有各种CaMKⅡδ抑制剂如KN-93和KN-62等，但目前临床相关的CaMKⅡ抑制剂还不存在。

3 PP1与CaMKⅡ在心肌病治疗中的比较。

综上所述，PP1与CaMKⅡ是一对去磷酸化与磷酸化蛋白质。虽然它们都是多功能蛋白酶，且都具有广泛的生理作用，但在调节心脏功能中，都是直接或间接参与对第二信使Ca2+的调控。心肌细胞内Ca2+浓度与心脏收缩和舒张功能密切相关，早期心肌细胞Ca2+浓度升高可使心肌收缩性加强，但Ca2+浓度持续升高将导致舒张功能障碍。此外胞质内Ca2+浓度升高还会引起一系列蛋白功能改变，进一步使胞质内Ca2+浓度增加，形成恶性循环，造成Ca2+超载，Ca2+超载可启动Ca2+介导的信号转导，并参与心肌肥厚的发生/发展。因此对心肌病的治疗其中一个关键点就是调节Ca2+稳态。在心肌病治疗中虽然单独抑制PP1或者CaMKⅡ均能改善细胞中Ca2+的稳态，但对PP1与CaMKⅡ的调控可能不能只单独抑制某一种，未来的治疗策略应该综合考虑两者的情况，同时加以调控。并且现在关于PP1与CaMKⅡ之间是否存在相互调节作用还有待研究。可以想象如果它们之间存在着相互调节，那么对这一通路进行调控应该更具有应用价值。

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