痛经康口服液对痛经大鼠子宫组织中催产素受体及加压素受体mRNA的表达的影响

赵伟国， 李运景， 黄 民

(1.中山大学药学院，广东广州510006;2.中山大学附属中山医院，广东中山528403)

痛经康口服液是元胡、当归、川芎、香附等十二味中药组成的纯中药复方制剂，来源于临床经验方，是中山大学附属中山医院制剂室开发的新的中药复方制剂，具有理气活血、通络止痛的功效，主要用于治疗多种原因引起的痛经、月经不调等病症。前期研究［1］表明本品具有较高的安全性和明显的抗炎镇痛作用。为明确本品的抗痛经作用及相关机制，本次研究采用实验性痛经大鼠模型，观察痛经康口服液抗痛经作用，并进一步揭示并探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 药品及试剂 痛经康口服溶液2.9 g生药/mL及1.45 g生药/mL(批号:20101108)，中山市人民医院自制;己烯雌酚注射液 (批号:100104)，上海通用药业股份有限公司;缩宫素注射液 (批号:0911262)，河南辅仁怀庆堂制药有限公司;市售对照品 (治疗对照)田七痛经胶囊 (批号:N08009、N11026)，广州敬修堂 (药业)股份有限公司;cDNA试剂盒 (Fermentas公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，三氯甲烷 (纯度 ＞99.8%)(美国Sigma公司)，DL2000 DNA Maker(博大泰克)，Agarose LE(MDBio，Inc.西班牙)，TaqDNA聚合酶 (上海申能博彩生物科技有限公司)，EB(广州威佳科技有限公司)Tris(The Dow Chemical Company)，Na2EDTA·2H2O(MBCHEM)，冰醋酸 (广州化学试剂厂)，DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)(美国Sigma公司)，催产素受体 (OTR)，加压素受体(VPR)，β-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 实验动物 SPF级SD大鼠，60只，雌性，150～170 g，广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明编号0075806。

1.3 实验仪器 BS—3000A电子天平 (上海友声衡器有限公司生产，感量0.1 g);台式离心机(德国Hettich，型号:Mikr020);UV7504型单光束紫外可见分光光度计 (上海欣茂仪器有限公司);低温高速离心机 (长沙平凡仪器仪表有限公司);CU420型电热恒温水箱 (上海一恒科技有限公司);酶标仪 TECAN TYPE:Sunrise Remote/TonchScreen(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，DG5033A型);LX—100手掌型离心机(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)，WO—9413B型凝胶成像系统 (北京六一仪器厂)，Hema3200基因扩增仪 (珠海黑马医学仪器有限公司)，POWER BC数控电泳仪 (上海申能博彩生物科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 剂量设计与分组

2.1.1 分组 正常对照组和模型对照组、田七痛经胶囊组、痛经康高、中、低剂量组，每组10只。

2.1.2 剂量设计 根据人服用剂量为50 mL/次(1.45 g生药/mL)，每天2次，得大鼠每天等效剂量为 ［50 mL×2/60 kg］×6.5=10.83 mL/kg(按每人60 kg体质量计算)。痛经康低、中、高剂量组为大鼠等效剂量的0.5倍、1倍及2倍，得痛经康低、中、高剂量组剂量分别为 7.85、15.70、31.41 g/(kg·d);田七痛经胶囊组剂量为2 g/kg。

2.2 造模及给药［2］除正常对照组外，各组大鼠股部皮下注射己烯雌酚，1次/d，连续11 d，其中第1天及第11天注射量为0.8 mg/只，第2天至第10天注射量为0.4 mg/只。皮下注射己烯雌酚的同时，正常对照组、模型对照组、田七痛经胶囊组、痛经康高、中、低剂量组大鼠按照1 mL/100 g灌胃给药，痛经康高、中、低剂量组给予相应质量浓度的痛经康口服溶液，田七痛经胶囊组给予0.2 g/mL田七痛经胶囊溶液，剂量为2 g/(kg·d)，正常对照组及模型对照组给予等量的生理盐水，连续给药11 d。于最后1次给药40 min后，所有大鼠按体质量4 U/kg腹腔注射缩宫素致大鼠扭体反应。

2.3 观察及指标检测

2.3.1 基本情况观察 从实验开始至实验结束，每天观察并记录大鼠的日常情况1次。给药第11天，于腹腔注射缩宫素后观察大鼠扭体反应发生的潜伏期、30 min内的扭体反应次数和扭体动物数。扭体反应标准:大鼠腹部收缩内凹，躯干与后肢伸展，臀部与一侧肢体内旋。体质量:实验开始和实验结束各称大鼠体质量1次。

2.3.2 标本采集及检测 测完扭体反应后1 h，按40 mg/kg体质量对大鼠进行戊巴比妥钠麻醉，分离腹主动脉，无菌采血约5 mL，分2份，1份置于肝素抗凝管后离心取血浆-80℃保存，另1份置于无抗凝管中，离心取血清-80℃保存待测。放血处死解剖取子宫组织，分2份，一份置于-80℃保存;另一份子宫组织置于4%多聚甲醛保存待用。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体见表1。

表1 引物合成序列Tab.1 Primer sequence

取冻存子宫组织100 mg按照逆转录试剂盒提供的实验步骤进行逆转录反应。取1 μL cDNA依次加 入 10 × buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L Primer 0.5 μL，Taq 酶 0.25 μL，ddH2O 19.25 μL，分别进入PCR循环。循环条件:95℃预变性5 min、94℃变性0.5 min，退火 (催产素受体54℃、加压素受体58.5℃、β-actin 57.2℃)0.5 min，72℃延伸1 min。催产素受体、加压素受体、β-actin共30个循环，循环终末72℃10 min终止反应。取PCR产物10 μL，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条带结果采用凝胶图像分析仪分析，计算目的产物与β-actin的OD比值，作为表达的半定量指标。

3 结果

3.1 基本观察 各个试验过程中，各给药大鼠在给药后被毛光亮，精神活动、大小便等均未见异常，口、眼、耳、鼻均未见异常分泌物。体质量:给药结束时模型对照组体质量较实验开始时略有减轻，与正常对照组比较明显减轻 (P＜0.01);其他各给药组体质量均较前增长，田七痛经胶囊组与痛经康低剂量组体质量较模型对照组明显增长 (P＜0.01)。结果见表2。

表2 对痛经模型大鼠体质量的影响 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

表2 对痛经模型大鼠体质量的影响 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，＊＊P ＜0.01。

/g正常对照组组别 样本数剂量/(g·kg-1)实验开始时体质量/g实验结束时体质量10 - 188.3±5.2 221.8±6.8模型对照组 10 - 186.2±8.7 183.3±15.5##田七痛经胶囊组 10 2.0 191.2±5.2 203.0±9.2＊＊痛经康低剂量组 9 7.85 190.7±8.2 206.8±10.9＊＊痛经康中剂量组 10 15.7 185.2±9.3 190.1±10.5痛经康高剂量组10 31.41 186.3±12.0 197.4±13.4

3.2 扭体反应 正常对照组10只大鼠未见出现扭体反应，其余各给药组均出现不同程度的扭体反应。痛经康低、中、高剂量组出现扭体反应的动物数量均较模型对照组减少，且呈剂量依赖关系。田七痛经胶囊组、痛经康中、高剂量组出现扭体反应潜伏期较模型对照组延长，30 min扭体反应次数较模型对照组减少，其中痛经康中剂量组与模型对照组比较扭体反应潜伏期明显延长 (P＜0.01)，但扭体反应次数无统计学差异。结果见表3。

3.3 子宫组织催产素及加压素受体mRNA表达与正常组比较，模型对照组痛经大鼠子宫催产素及加压素受体mRNA表达显著增高 (P＜0.01)，而田七痛经胶囊组、痛经康低、中、高剂量组可不同程度降低痛经大鼠子宫催产素及加压素受体mRNA表达 (P＜0.01，P＜0.05)。结果见表4，图1，图2。

表3 对大鼠痛经模型扭体反应的影响 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

表3 对大鼠痛经模型扭体反应的影响 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，＊＊P＜0.01。

/%正常对照组组别 样本数 剂量/(g·kg-1) 扭体潜伏期/min 30 min扭体次数 扭体动物数/只 扭体百分率10 - 00模型对照组 10 - 11.26±4.65## 10.23±10.28## 8 80.0##田七痛经胶囊组 10 2.0 12.24±5.03 5.88±5.33 8 80.0痛经康低剂量组 9 7.85 7.26±1.93 14.25±6.50 7 77.8痛经康中剂量组 10 15.7 19.42±6.50＊＊ 4.00±4.47 6 60.0痛经康高剂量组10 31.41 14.50±4.32 5.00±5.39 4 40.0

表4 对痛经模型大鼠子宫组织催产素受体及加压素受体mRNA表达的影响 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

表4 对痛经模型大鼠子宫组织催产素受体及加压素受体mRNA表达的影响 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

注:与正常对照组比较，##P＜0.01;与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

-actin正常对照组组别 样本数 剂量/(g·kg-1)OTR mRNA/β-actin VPR mRNA/β 10 - 0.528±0.144 0.544±0.212模型对照组 10 - 0.798±0.139## 0.923±0.169##田七痛经胶囊组 10 2.0 0.648±0.161* 0.720±0.190*痛经康低剂量组 9 7.85 0.650±0.161* 0.744±0.181*痛经康中剂量组 10 15.7 0.627±0.156* 0.650±0.180＊＊痛经康高剂量组 10 31.41 0.641±0.138* 0.678±0.148＊＊

图1 催产素受体mRNA表达Fig.1 The mRNA expression levels of OTR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

图2 加压素受体mRNA表达Fig.2 The mRNA expression levels of VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

4 讨论

原发性痛经的发病机制尚未完全明确，但有大量研究显示原发性痛经与多种原因有关，主要和前列腺素 (PG)有关［3］，其次催产素与加压素也是痛经发生两个重要致病因素。催产素不仅可直接作用于子宫肌细胞，通过细胞内生化途径引起子宫收缩，同时还能激活磷酸肌醇循环，调节局部前列腺素的产生，引起并加重痛经［4］。催产素能刺激PGF2α的合成与释放，PGF2α能增加催产素的释放而不影响其合成，两者具有协同作用，共同导致子宫收缩［5］。催产素作用于平滑肌细胞的催产素受体升高细胞内Ca2+，直接刺激其收缩，而催产素与内膜催产素受体结合后，诱导内膜上皮细胞产生PGF2α，以旁分泌方式刺激平滑肌收缩［6］。研究表明随着痛经妇女在月经早期激素水平的升高，加压素成为子宫平滑肌的活动增加子宫血流减少的一个重要因素［7］。正常情况下排卵期血浆中血管加压素水平最高，黄体期下降直至月经期。原发性痛经妇女晚黄体期雌激素水平异常升高，所以在月经期第一天血管加压素水平高于正常人2～5倍［8］。痛经患者对血管加压素的敏感性较高，加压素主要通过作用于子宫加压素受体，引起子宫肌层及动脉壁平滑肌收缩加强，使子宫血流减少，从而引起子宫局部缺血，疼痛加剧。加压素也能通过促进前列腺素生成和增加子宫平滑肌对缩宫药物的敏感性，减少子宫血运而致痛经。并且催产素受体和加压素还具有部分交叉作用［9］。应用催产素及加压素拮抗剂阿托西班及SR 49059［10］时可以缓解痛经的症状，这都说明催产素及加压素参与了痛经的发生。本研究结果显示大鼠经注射己烯雌酚，催产素及加压素受体mRNA表达升高，对催产素反应敏感性增强。预防性用药后产生明显的抗痛经作用，这可能与痛经康低、中、高剂量组不同程度降低痛经大鼠子宫催产素及加压素受体mRNA表达，降低对催产素反应敏感性有关。

痛经属中医“经行腹痛”范畴，主要是由于妇女在行经期间受到致病因素的影响，导致冲任郁阻或寒凝经脉，使气血运行不畅，胞宫经血流通受阻，以致不通则痛;或冲任、胞宫失于濡养，不荣则痛［11］。有研究表明［12］，原发性痛经的主要中医证型为气滞血瘀证、寒凝血瘀证、肝郁气滞证、肝肾亏损证、气血虚弱证等，其中以气滞血瘀证为最多。气滞血瘀证因多抑郁，复伤情志，肝郁则气滞，气滞则血滞，以致血海气机不行，经血运行不畅，发为痛经。痛经康口服液原方由红花、桃仁、元胡、当归、川芎、香附等十二味中药组成，来源于临床经验方，具有理气活血、通络止痛的功效，主治中医辨证气滞血瘀之痛经、月经不调等病。方中红花善通利经脉，为血中气药［13］994，桃仁为血瘀血闭之专药［13］1789。二者相须为用活血通经、化瘀止痛。元胡能理气活血、调经止痛，辛散温通，为活血行气止痛之良药［14］803。当归补血活血，调经止痛，为血中之气药［13］879。川芎性善散，又走肝经，气中之血药［13］222。丹参活血调经，祛瘀止痛，善治血分，去滞生新，调经顺脉［13］482。香附为气病之总司，女科之主帅［14］890，可疏肝理气，调经止痛，为调理冲任气血之要药。川楝子主入肝经，疏泄肝热，行气止痛。本方以红花、桃仁、元胡为君药，当归、川芎、丹参加强活血止痛之效，香附、川楝子加强理气止痛之效，共为臣药。佐以白芍、蒲黄、五灵脂，诸药相合共奏活血通经、理气止痛之效，从而使胞宫气血运行通畅而达通则不痛之功。

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