HPLC法测定蜜炙款冬花中4种黄酮类成分

王福刚， 曹 娟， 齐永秀， 钮厚发

(泰山医学院药学院，山东泰安271016)

款冬花为菊科款冬属植物款冬Tussilago farfara L．的干燥花蕾，又称冬花、虎须、九尽草［1］，性辛，微苦，温，归肺经，具有润肺下气，止咳化痰之功效。临床上主要用于新久咳嗽，咳喘痰多，劳嗽咳血［2］，为止咳平喘方剂中的常用药。本品已报道的化学成分包括萜类，黄酮类，生物碱，多酚类，挥发油等［3-7］，已有文献报道采用HPLC法分别测定款冬花中芦丁、槲皮素、金丝桃苷［8-12］。款冬花常以其炮制品——蜜炙款冬花入药，有关蜜炙款冬花的研究文献报道不多。本实验建立了同时测定蜜炙款冬花中4种黄酮类化合物的方法，为其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

LC—10Avp高效液相色谱泵，SPD—10Avp紫外检测器，N2000色谱工作站 (日本岛津);FA1004电子天平 (上海兰科仪器有限公司);KQ—500DB超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

对照品芦丁 (批号:100080-200707)、槲皮素(批号:100081-200907)购于中国药品生物制品检定所。山柰酚 (纯度 98%)、金丝桃苷 (纯度98%)购于天津一方科技有限公司。

款冬花01(产地山西)购于济南建联大药房，款冬花02(产地河北)购于山东省中医院药房，款冬花03(产地河北)购于山东天一中药饮片有限公司。

蜜炙款冬花1、蜜炙款冬花2、蜜炙款冬花3分别为款冬花01、02、03按《中国药典》2010年版一部蜜炙炙法自制。蜜炙款冬花04(产地重庆)购于泰安中心医院药房，蜜炙款冬花05(产地陕西)购于济南同仁堂药店，蜜炙款冬花06(产地河南)购于泰安市龙潭大药店，蜜炙款冬花07(产地甘肃)购于泰安市绿地大药房，蜜炙款冬花08(产地安徽)购于安徽颐生堂中药饮片有限公司，蜜炙款冬花09(产地山东)购于山东鄄城志远中药饮片有限公司，蜜炙款冬花10(产地山东)购于山东永春堂中药饮片有限公司，蜜炙款冬花11(产地河南)购于泰山为民大药房，蜜炙款冬花12(产地河南)购于泰安益民药店，经本院生药教研室鉴定均为菊科植物款冬Tussilago farfara L．的花蕾。

甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为大连依利特C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相A为0.1%磷酸，B为乙腈，梯度洗脱，0～30 min、10% ～25%B，30～40 min、25% ～75%B，40～50 min、75% ～100%B，50～60 min、100%B;检测波长240 nm;体积流量1.0 mL/min;室温;进样量20 μL。在上述色谱条件下得到的对照品及样品的色谱图见图1。

图1 混合对照品 (A)和供试品 (B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 混合对照品贮备液的制备 取芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚对照品适量，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为2.05、1.05、0.47、0.32 mg/mL的对照品溶液。分别精密量取各质照品溶液5 mL置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为410、210、94、64 μg/mL的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备 取蜜炙款冬花药材粉末(过三号筛)1 g，精密称定，加入20 mL乙醇，超声1 h，滤过，乙醇定容至25 mL，摇匀，精密量取5 mL，水浴蒸干，用5 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 依次精密吸取混合对照品贮备液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分别置 25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，分别进样20 μL，记录色谱图。以各对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程:芦丁Y=16 656 963.05X+33 676.05(r=0.999 3);金丝桃苷 Y=30 982 497.84X+65 144.46(r=0.999 0);槲皮素 Y =39 406 527.14X + 110 815.92 (r=0.999 3);山柰酚Y=46 630 399.82X+66 058.63(r=0.999 2);表明芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚分别在 1.64 ～164 μg/mL、0.84 ～84 μg/mL、0.376 ～37.6 μg/mL、0.256 ～25.6 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液 (芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚的质量浓度分别为410、210、94、64 μg/mL)，在上述色谱条件下重复进样6次，结果芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的峰面积RSD分别为1.4%、2.1%、1.8%、1.1%。

2.6 重复性试验 取蜜炙款冬花01号药材粉末(过三号筛)，按2.3项下方法操作，平行制备6份供试品溶液，进样分析，计算芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚质量分数的RSD分别为1.5%、1.9%、2.5%、3.0%。

2.7 稳定性试验 取蜜炙款冬花01号样品的供试品溶液，室温放置，按2.1项色谱条件，分别于0、2、4、8、10、12 h进样分析，计算芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚色谱峰面积RSD分别为2.1%、1.5%、3.1%、2.9%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 称取蜜炙款冬花01号样品9份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入对照品适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算回收率和RSD，结果见表1。

2.9 样品测定 取不同来源的款冬花、蜜炙款冬花各3份，依法制备供试品溶液，进样分析，记录色谱峰，计算芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的质量分数，结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本实验考察了220、240、280、320、350 nm多个检测波长，结果240 nm时，样品中质量浓度较小的槲皮素有较大吸收值，峰形良好，选定为检测波长。

表1 加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery

表2 样品测定结果 (n=3)Tab.2 Determination of samples(n=3)

3.2 提取方法的选择 考察了不同提取方法 (超声、回流、冷浸)、不同溶剂 (不同质量分数乙醇)、不同提取时间、不同料液比对款冬花中黄酮类成分提取率的影响，结果采用95%乙醇，料液比1∶20，超声提取1 h，黄酮类成分提取率最高。

3.3 色谱条件的选择 考察了不同系统的流动相，比较了磷酸-乙腈系统、冰醋酸-乙腈系统、甲酸-乙腈系统、磷酸-甲醇-乙腈系统，结果表明，在0.1%磷酸-乙腈洗脱条件下，4种黄酮类成分峰分离度较好;另外还对多个不同的洗脱梯度进行了考察。

3.4 样品测定 不同批次蜜炙款冬花芦丁质量分数在0.047% ～0.278%之间，金丝桃苷在0.014%～0.109%之间，槲皮素在0.002% ～0.012%之间，山柰酚在0.001% ～0.019%之间。其中第11批 (产地河南)和第12批 (产地河南)黄酮类成分含有量较高，质量较好。款冬花经蜜炙后，芦丁和金丝桃苷质量浓度降低，槲皮素和山柰酚质量分数变化不大。

采用HPLC法同时测定蜜炙款冬花中4种黄酮的含有量，方法准确，简便，可以用于蜜炙款冬花的质量控制。

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