基于抗氧化活性测定的山药品质评价新方法

李寒冰， 齐向云， 李根林*， 陈 磊

(1.河南中医学院药学院，河南郑州450008;2.广东药学院中药学院，广州广东510006)

相对于化学药，中药成分复杂、药理活性广泛，单一指标性成分定量测定难以全面反映其内在品质，而中药指纹图谱也只是反映中药的化学信息，难以直接体现其药效信息［1-4］。此外，囿于现有分析分离手段、成分的稳定性、对照品等因素的制约，当前仍然有一部分中药品种不能以指标性成分定性/定量分析进行质量控制。 《中国药典》2010年版编制大纲明确指出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化，由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》2010年版 (一部)附录收载。本研究选用传统补益类中药山药为示范，探索性开展了与“补益”药效相关的生物活性检定方法的研究。

山药Dioscoreae Rhizoma为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎，品系繁多药材品质差异性较大，且成分复杂、药效物质基础不明确，当前《中国药典》并未收载有效成分 (或指标性成分)的定量测定法对山药进行质量控制［5］。本研究首次探索建立以药效为基础的山药品质生物学评价方法，作为中国药典常规和化学测定的补充与提高，旨在从多重角度共同把关山药内在质量，完善现行质量控制和评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的补益类中药质量控制与品质评价研究提供新的思路和参考。

药理研究表明山药具有抗衰老、抗糖尿病、抗肿瘤等药理作用［6-7］，从中医角度看这些疾病以及机体的衰老的进程中往往呈现出肾虚症状，而这些病变与体内自由基积累有很大关系［8］;山药是常用的“补肾”中药［5］，临床常用于对上述疾病的治疗与预防往往取得较好疗效;且山药中的多糖、不饱和脂肪酸、多酚等本身都是天然的抗氧化剂。目前抗氧化活性被认为是山药“补益”作用机制之一［9］。因此，本实验从抗氧化活性方面探讨建立山药的品质评价方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

1.1.1 仪器 SZ—93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂;BS210S型分析天平，北京赛多丽斯天平有限公司;KQ—100型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;80—2型离心沉淀机，巩义市英峪予华仪器厂;SHZ—D(Ⅲ)型豫华牌循环真空泵，巩义市英峪予华仪器厂;UV1000紫外-可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司;移液枪 (500 μL)，上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.1.2 材料与试剂 编号为1～13号的山药样品分别购自河南郑州市的药店和中药材批发市场，随机编号，编号为14～23号的山药饮片由河南中医学院中药炮制实验室利用新鲜山药 (购自郑州市5家铁棍山药专店)的根茎，按照《中国药典》2010年版收载的标准制备而成，实验所用山药样品经河南中医学院药学院陈随清教授鉴定，均为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥或新鲜根茎;维生素E胶丸 (国药准字H20043134，批号:001008)，青岛双鲸药业有限公司。

DPPH·试剂，美国Sigma公司;无水乙醇 (分析纯)，天津市凯通化学试剂有限公司;双蒸馏水 (新鲜，自制)。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 取山药样品粉碎，过40目筛。取3 g粉末，精密称量，置干燥锥形瓶，加10倍量75%乙醇 (体积分数，下同)超声提取30 min，真空抽滤，弃残渣，挥干溶媒，干燥提取物用30 mL 75%乙醇溶解，制成供试品溶液。置冰箱冷藏室 (0～4℃)保存，备用。

1.2.2 工作对照品溶液的制备 取1～13号山药样品等质量混合，粉碎，过40目筛。其溶液制备方法同1.2.1项下。

1.2.3 阳性对照品溶液的制备［10-12］取维生素 E胶丸(100 mg/粒)4粒，剪破胶丸壳，用20 mL无水乙醇溶解，所得维生素E溶液质量浓度为20 mg/mL，作为本次试验的阳性对照品。

1.2.4 DPPH·自由基溶液的制备 精密称取0.04 g DPPH·自由基，用无水乙醇溶解，移至500 mL量瓶定容，所得DPPH·溶液的浓度为20 mmol/mL，置冰箱 (0～4)℃避光保存，备用。

1.2.5 加样与检测［13-14］取样品溶液，以0.7剂距配制成9组，分别按表1加样于离心试管中，充分混匀，室温下避光、静置反应30 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液在517 nm波长处测定吸光度 (A)。每一吸光值平行测3次，取其平均值 (注意进行校正吸光度)。清除率按下列公式计算:

表1 加样方法与加样量

1.2.6 IC50的选择和效价的测定 由1.2.5项下测定的结果，利用Reed Muench法求出工作对照品和10批山药样品试液的IC50，以IC50临近的4个质量浓度梯度测定各山药试液的DPPH·清除率，计算其效价。

本实验中暂时以1～13号山药样品均匀混合物的75%乙醇提取物作为山药效价测定时的工作对照品，为方便计算，约定本工作对照品的效价 (PS)为100.0 U/mg。按照生物检定量反应平行线法 (2·2)法进行实验设计，依1.2.5项的步骤进行加样与检测，对不同批次样品与工作对照品进行对比检定，结果采用《中国药典》生物检定程序BS2000进行效价计算。

2 结果

2.1 山药抗氧化活性检测和量效关系考察 阳性对照药维生素E的IC50为5.73 mg/mL，山药工作对照品S的IC50为3.81 mg/mL(生药质量浓度，下同)，样品6的 IC50为10.35 mg/mL，三者量-效曲线形状基本相同 (见图1)，自由基清除率与对数剂量的自然对数值之间呈良好的对称“S”形曲线 (见图2)，提示山药与维生素E的抗氧化作用趋势在一定范围内基本相同。

图1 山药的抗氧化活性量-效曲线图

图2 山药的抗氧化活性量-效对数曲线图

2.2 线性关系考察 以工作对照品S和6号样品考察结果为例:工作对照品线性方程为y=38.658ln(x)-39.057，R=0.990 00，在2.11～12.53 mg/mL质量浓度范围内，显示了良好的线性关系;6号样品线性方程为y=35.076ln(x)-4.781 2，R=0.990 2，在4.15～24.69 mg/mL质量浓度范围内显示了良好的线性关系 (见图3)。说明此反应类型在一定范围内适合用生物检定中“量反应平行线测定”法进行效价测定。

图3 山药抗氧化活性的线性考察

2.3 效价计算

2.3.1 可靠性检验 6号样品可靠性检验结果分析:试品间差异不显著 (P＞0.05)，说明供试品和工作参照物效价无明显差别。回归项差异显著 (P＜0.01)，说明随着质量浓度的降低自由基清除率值有规律地降低;同剂间差异有显著意义 (P＜0.01)，说明试验计量比例和试验安排合理。偏离平行线的差异无显著意义 (P＞0.05)，说明S和T呈平行直线关系，所测得结果有效 (见表2)。

表2 6号山药样品生物效价 (2·2)法测定的可靠性检验结果

2.3.2 效价与可信限 以6号样品为例，测得效价PT=0.175 37 U/mL，效价的可信限率为 FL=8.893 7%，即该样品效价在0.154 09～0.185 29 U/mL范围内是可信的。

2.3.3 实际样品检测结果与分析 编号为1～13号的样品分别购自河南郑州市两家药店和郑州市中药材批发市场，测得其抗氧化效价差别显著，表明该方法可以对不同来源、批次及储藏管理等条件下的山药进行区分，也提示这些山药批次间品质存在差异。14～23号样品为本实验室采用新鲜山药自制的饮片，偶数号与相邻的奇数号来源于同一批次新鲜样品 (如14与15号是由同一批山药新鲜根茎制备而成，其余类推);14、16、18、20、22号样品为除去外皮的山药;15、17、19、21、23号样品为具皮山药。14～23号结果显示带皮山药饮片效价明显高于去皮饮片。编号24为工作对照品 (见图4)。

图4 23批山药饮片抗氧化活性效价

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 取同一编号相同质量浓度的山药供试品溶液5份，求得自由基清除率分别为56.83%、57.55%、57.74%、56.44%、56.00%，RSD值为1.29%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性 用同一编号的山药样品粉末5等份，分别依1.2.1项的步骤制成供试品溶液，按1.2.5项和1.2.6项的步骤计算效价，5次测得结果依次为0.79、0.84、0.81、0.76、0.76 U/mg，RSD值为4.31%，表明该方法具有较好重复性。

2.4.3 稳定性 用同一编号相同浓度供试品溶液分作5份，分别于0、2、4、6、8 h后加DPPH·反应，进行效价检测，5次测得效价依次为0.75、0.79、0.84、0.85、0.81 U/mg，RSD值为4.98%，表明样品溶液在10 h内基本稳定。

3 讨论

山药的补益作用与其抗氧化活性密切相关。现有的山药抗氧化活性测定方法往往涉及实验动物及较复杂的生化检测，多数存在步骤繁琐、重复性差、试验成本高等局限性，不适宜用于山药质量的生物测定。DPPH·法具有简便、灵敏、重复性好等特点，是公认度高的体外抗氧化测定方法之一。本研究采用DPPH·测定法测定山药的抗氧化活性初步得到比较满意的效果。

从某种意义上来讲，中药生物活性测定与化学成分含有量测定相比，更具有优势，它反映了中药的整体效应，符合中医药的整体观［15］。理论上多数药理方法通过数理统计均可用作生物测定方法，但由于药品检验工作对生物测定的要求有其特殊性，以及多数中药量效关系不明显，一般的药理方法并不适合作为生物检定方法，故应当对生物活性检测方法进行筛选、优化和选择。本研究所建立方法在药效相关的基础上，重点兼顾了检验方法的“重复、灵敏、快捷、易量化、经济安全”等原则［16］，以便于推广与应用。

生物效价测定方法所使用的对照品是保证其准确性与可靠性的重要基础之一，所以应选用有“同质”或“基本同质”的参照物 (对照品)，以测定供试品的相对效价［17］。由于中药质量的生物活性测定是近年来提出的新型中药质量控制方法，对于对照品的制备或选用“中药生物活性测定指导原则”等尚未有明确规定。中药定量测定采用的对照品是高纯度单体化合物，由于中药具有多成分、作用多靶点、多环节等特点，对照品纯度越高，可能反而越不能代表中药的内在品质。中药生物效价测定用的对照品的选择应以“有代表性的混合体”作为参照物，对此本课题组有专门报道［18］。基于上述考虑，本实验暂定以多批样品的混合物制备成工作对照品以供方法学研究之用，有待于在后续研究中对“对照品”进行专门的规范化研究。

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