桔梗边角料中桔梗多糖的分离纯化研究

华 芳， 王举涛， 桂双英，2，3*

(1.安徽中医学院药学院，安徽合肥230031;2.安徽省中药制剂工程技术研究中心，安徽合肥230031;3.现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥230031)

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon gradiflorum(Jacq．)A．DC．的干燥根，性平，味苦、辛，具有化痰止咳、利咽开音、宣畅肺气、排脓消痈的功效。桔梗中主要含有三萜皂苷、多糖类化合物、黄酮类化合物等成分［1-2］。桔梗多糖具有免疫调节、抗炎、祛痰、保肝、降血脂、抗氧化等方面的药理作用［3］。桔梗边角料 (包括须根、皮等)和地上部分 (茎、叶等)一般都是丢弃不用，在一定程度上造成了资源的浪费。因此，本实验以桔梗边角料为原料对其多糖进行分离纯化研究。

1 材料与仪器

桔梗边角料 (安徽省太和县利民中药材有限责任公司提供);DEAE-52纤维素、葡聚糖凝胶G-200(北京瑞达恒辉公司提供)，其余试剂均为分析纯。紫外可见分光光度计 (上海精科UV757)，Agilent 1100 HPLC色谱仪。

2 方法

2.1 提取［4］称取桔梗边角料10 g，加25倍水，80℃提取3次，每次1 h，合并提取液，放冷，取上清液浓缩，加入乙醇至含醇量80%，静置24 h，抽滤，滤饼加水至完全溶解，浓缩，加乙醇至含醇量80%，静置24 h，抽滤，50℃减压干燥。粗多糖得率7.97%。

2.2 分离纯化研究

2.2.1 脱蛋白工艺考察［5-6］取粗多糖2份，精密称定，加蒸馏水溶解，定容至100 mL，一份按照V样品∶V试剂为5∶1的比例加入Sevag试剂 (V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)萃取3次，取上层液，浓缩;另一份加入10%三氯乙酸，静置24 h，离心 (4 000 r/min，10 min)，取上清液，用10%NaOH溶液调pH至7。结果见表1。

表1 2种不同方法脱蛋白的效果比较 (n=3)

由表1可知，Sevag法脱蛋白效果更好。

2.2.2 脱色工艺考察［7-8］取脱蛋白后的多糖溶液，浓缩，分别加入1%、2%、3%的活性炭，于80℃下水浴30 min，过滤。结果见表2。

表2 3种不同质量分数活性炭脱色的效果比较 (n=3)

由表2可知，2%活性炭，80℃水浴脱色30 min为桔梗多糖的最佳脱色工艺。

2.2.3 DEAE-52纤维素柱层析［9-10］取上述脱蛋白、脱色的桔梗多糖样品上 DEAE-52纤维素柱，依次用蒸馏水、0.05 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脱。每2 mL为一个流份，隔管采用苯酚-浓硫酸法在486 nm的波长下测定吸光度值，至无多糖检出时更换至下一梯度洗脱，绘制洗脱曲线见图1、图2。

图1 桔梗中性多糖DEAE-52洗脱曲线

图2 桔梗酸性多糖DEAE-52洗脱曲线

由洗脱曲线可知有一个桔梗中性多糖，3个桔梗酸性多糖，4个组分分别命名为 PG、PG1、PG2、PG3。由于PG1、PG3峰值较小，仅对PG、PG2作进一步研究。

2.2.4 SephadexG-200凝胶柱层析 PG、PG2分别过SephadexG-200凝胶柱，每2 mL一管，苯酚-浓硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线见图3、图4，所示仍然为一个单一对称的洗脱峰，这说明PG、PG2在相对分子质量分布上都是均一的多糖。

2.3 PG单糖组成分析［11-13］

2.3.1 酸水解 精密称取PG，加入1 mol/L稀盐酸沸水浴下水解，冷却后，用1 mol/L氢氧化钠溶液中和后减压浓缩至干燥。

2.3.2 薄层层析 取酸水解后的样品10.0 mg，加1 mL甲醇配成10 mg/mL的PG水解样品溶液。分别称取葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖各10.0 mg，分别加入1 mL甲醇，配成10 mg/mL的标准单糖溶液。展开剂为正丁醇-冰醋酸-水 (4∶1∶5)(上层)。显色剂为α-萘酚-硫酸。结果见图5。

图3 PG SephadexG-200洗脱曲线

图4 PG2 SephadexG-200洗脱曲线

图5 桔梗多糖薄层色谱图

由图5可知，PG水解物在果糖相对应的位置显相同的蓝色斑点，由此推断PG主要由果糖组成。

2.4 PG相对分子质量测定

2.4.1 色谱条件 SHODEX PROTEIN KW-802.5凝胶色谱柱，G1362A示差折光检测器，流动相为100%水，体积流量为1.0 mL/min，柱为30℃。

2.4.2 标准曲线的制备 供相对分子质量测定用右旋糖酐对照品 (对相对应分子质量为20 000、40 000、50 000)，配制成质量浓度为1 mg/mL的对照品系列溶液。以色谱峰的保留时间 (t)为横坐标，标准分子量的对数值 (lgMw)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为lgMw=－0.033 2x+5.672 7(R=0.996)。

2.4.3 样品测定 精密称取PG，用流动相配制成质量浓度为1 mg/mL的样品液，进样，测得保留时间为48.304 min，见图6所示，通过外推法得出PG的相对分子质量为11 749。

3 讨论

图6 PG的GPC色谱图

3.1 Sevag法脱蛋白具有条件比较温和，对桔梗多糖脱蛋白率高而多糖损失率低的特点，所以适用于桔梗多糖中蛋白质的去除。

3.2 桔梗粗多糖经过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-200凝胶柱，得到的两种多糖均为单一对称的洗脱峰，所以为均一的多糖组分，其中PG的相对分子质量为11 749，由于PG2通过DEAE-52纤维素柱洗脱后含有大量的NaCl，影响TLC及相对分子质量的测定，因此还需要进一步进行脱盐处理，所以PG2的相对分子质量及其结构分析将在后期进行研究。

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