高效液相色谱法测定不同方法提取非洲马铃果中的柳叶水甘草碱

王 荣， 李多伟

(西北大学生命科学学院，陕西西安710069)

非洲马铃果Voacanga africana Stapf又名非洲伏康树、非洲沃坎加树，是一种产自非洲的夹竹桃科植物。这种植物在新几内亚、印度尼西亚和菲律宾被记录过，它被描述为在亚洲很普遍，而且是最容易变异的种类。国外研究发现，非洲马铃果的提取物对体外大鼠臂旁核神经元兴奋和突触传递具有调节作用［1］，其树皮提取物对实验性胃溃疡大鼠有抗溃疡效应［2］，对62.5% ～87.5%的小鼠的惊厥及转向行为紊乱有抑制作用［3］。近年来，对非洲马铃果药用价值的研究认为，非洲马铃果提取物可用于治疗中风后遗症、缺血性高血压脑病等，还有提高记忆力，改善视力，抗衰老等作用。因此，近年来非洲马铃果的应用价值受到越来越广泛的关注。

柳叶水甘草碱 (Tabersonine)又名它波宁，是非洲马铃果中的一种单吲哚类生物碱，属长春花属生物碱中的白坚木碱型。分离纯化的柳叶水甘草碱为油状液体，弱碱(pKa=5.77)，分子式为C21H24N2O2;猫体试验结果显示，柳叶水甘草碱有降血压的作用，其强度为利血平的25%［4］。柳叶水甘草碱作为重要药物长春胺的合成前体［5］，具有重要的开发利用价值。长春胺可用于治疗慢性缺血性脑血管病、脑梗塞、老年痴呆等症［6-8］，具有活血降压、改善视力、抗衰老和抗氧化等作用［9-11］。目前，长春胺虽已可人工全合成，但以柳叶水甘草碱为前体半合成长春胺的思路，启发了一种长春胺获得的新途径。又因柳叶水甘草碱在非洲马铃果中的含有量相对较高，可达到2%［12］，且市面上对其需求日益增加，因此可通过从非洲马铃果中提取来进行工业生产。本实验致力于建立一种准确、高效、快捷的柳叶水甘草碱测定方法，以期为柳叶水甘草碱的测定提供科学有效的检测手段，并对提取条件做优化筛选，为实际生产提供引导。

1 仪器与试药

岛津LC—20A型高效液相色谱系统:包括LC—20AT型高压恒流泵、SPD—20A检测器和LC Solution工作站;柳叶水甘草碱对照品 (美国Sigma公司);非洲马铃果 (英杰华纳生物工程有限公司);乙腈为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯，水为二次蒸馏水，流动相经过0.45 μm微孔滤膜滤过。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Inertsil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.1 mol/L碳酸铵溶液 (7∶3，v/v);体积流量1.2 mL/min;检测波长275 nm;柱温为室温;进样量20 μL。在该色谱条件下，柳叶水甘草碱的保留时间约为15 min，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 色谱条件优选 本实验对比了0.7 mL/min，1.0 mL/min和1.2 mL/min 3种体积流量下柳叶水甘草碱的分离效果，结果表明体积流量对柳叶水甘草碱的峰形影响不大，只对保留时间有较大的影响。在0.7 mL/min体积流量下样品中柳叶水甘草碱出峰时间大约在26 min左右，1.0 mL/min体积流量下保留时间约为18 min，而在1.2 mL/min体积流量下保留时间约为15 min。本实验选择体积流量为1.2 mL/min。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取柳叶水甘草碱对照品0.050 0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液，贮存备用。

2.4 样品溶液的制备

2.4.1 冷浸提取 准确称取5.00 g非洲马铃果粉末12份，分别浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每种溶剂3份。冷浸24 h，过滤，滤液分别用各自溶剂定容至50 mL，贮存备用。

2.4.2 热回流提取 准确称取5.00 g非洲马铃果粉末12份，分别浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每种溶剂3份。热回流提取1.5 h，过滤，滤液分别用各自溶剂定容至50 mL，贮存备用。

2.4.3 超声提取 准确称取5.00 g非洲马铃果粉末12份，分别浸于50 mL 95%甲醇、95%乙醇、正己烷和石油醚中，每种溶剂3份。超声法提取30 min，过滤，滤液分别用各自溶剂定容至50 mL，贮存备用。

2.5 供试品溶液的制备 精密吸取2.4项中各样品溶液1 mL，蒸干溶剂，分别加甲醇超声溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取2.3项中对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL定容至10 mL。按2.1项中色谱条件测定，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=15 749X－1 092，r=0.999 5，线性范围为0.02～0.2 mg/mL。

2.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液20 μL，按2.1项中色谱条件重复进样5次，结果峰面积积分值的 RSD为0.75%。

2.8 加样回收率试验 精密吸取已测定的样品溶液2 mL，共5份，分别加入2.3项中的对照品溶液0.5 mL，按2.5项中方法制备成供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后供HPLC检测，进行加样回收率试验，结果见表1。

2.9 样品测定 将2.5项中制备的供试品溶液，按2.1项中色谱条件进行测定，结果见表2。

由表2可知，以柳叶水甘草碱含有量为指标，冷浸法中各溶剂提取率大小依次为正己烷＞95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚;热回流法为95%甲醇＞95%乙醇＞正己烷＞石油醚;超声法为95%甲醇＞95%乙醇＞石油醚＞正己烷。

此外，以HPLC色谱图中杂质峰出现的多少为指示，可知95%甲醇和95%乙醇提取的样液中杂质较多，正己烷和石油醚提取的样液中杂质较少。

表1 柳叶水甘草碱加样回收实验结果(n=5)

表2 不同方法提取柳叶水甘草碱的结果比较(n=3)

总之，3种方法中以热回流法提取柳叶水甘草碱含有量最高，分别达到冷浸法和超声法的约3.6倍和1.5倍。优选溶剂时，综合考虑提取量和杂质量的双重因素，确定最佳提取溶剂为正己烷。

3 讨论

目前，柳叶水甘草碱的测定方法国内报道甚少，本研究建立了柳叶水甘草碱测定的高效液相色谱法，并对测定柳叶水甘草碱的色谱条件进行了优化筛选，结果显示，当流动相体积流量为1.2 mL/min时保留时间最短，约为15 min。

此外，在上述建立的检测方法下对不同方法提取的非洲马铃果中柳叶水甘草碱进行了测定，并对4种溶剂的提取率进行考察，结果显示，冷浸法中以正己烷提取率最高，热回流法和超声法中均以95%甲醇提取率最高，但较正己烷和石油醚而言，95%甲醇和95%乙醇提取的样液中杂质较多，考虑到后续纯化工作的需要，选择正己烷热回流法提取非洲马铃果中的柳叶水甘草碱。因此，综合考虑，确定最佳提取方案为正己烷热回流法。

从非洲马铃果中提取柳叶水甘草碱最大的好处就是获得量高。经测定，本实验中确定的正己烷热回流法提取的柳叶水甘草碱质量分数约为0.7%，具备生产的含有量要求，因此可用于实际生产。

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