RP-HPLC法测定月腺大戟 (狼毒)中2种活性成分

袁海建， 程林兵， 蔡宝昌， 李俊松， 陈宜刚

(1.泰州职业技术学院，江苏泰州225300;2.国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210029;3.福建农林大学，福建福州350002)

月腺大戟为大戟科Euphorbiaceae大戟属Euphorbia月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．的块状根，是中药狼毒的原植物之一。具有抑菌杀虫［1-2］作用，民间还用于抗结核［3］和抗肿瘤［4-5］等。近年来的研究［6］表明，其主要有效成分［7］有狼毒乙素、狼毒丙素等化合物。为了更好的控制狼毒药材的质量，本实验报道了月腺大戟中狼毒乙素、狼毒丙素两种有效成分的HPLC的分析方法，在实际样品的分析中取得了满意的结果。

1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪，包括柱温箱、在线脱气机、四元泵及二极管阵列检测器 (美国 Agilent公司);AG285电子天平 (瑞士METTLER公司);KQ—500E型超声清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

狼毒乙素对照品、狼毒丙素对照品 (江苏省中国科学院植物研究所惠赠，纯度＞99%);月腺大戟药材 (分别购自亳州药材总公司，批号:100606、100822，南京同仁堂药 业 有 限 公 司， 批 号:2010100060、2010090020、2010090060、2010100010)经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定均为月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．正品;乙腈 (美国Tedia公司，色谱纯)，纯净水 (娃哈哈有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件 Welchrom-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温30℃;流动相为乙睛 (A)-水 (B)梯度洗脱，0～11 min，25%A，75%B;11～12min，25% ～45%A，75% ～55%B;12～20min，45% ～70%A，55% ～30%B;20～21 min，70% ～25%A，30% ～75%B。体积流量1.0 mL/min;进样量20 μL;检测波长290 nm。按照上述色谱条件进行测定，结果显示狼毒乙素、狼毒丙素与其他杂质峰得到很好的分离。各成分理论塔板数不低于4 500。见图1。

图1 对照品 (A)和药材 (B)HPLC色谱图

2.2 供试品溶液的制备 取各样品粉末 (过三号筛)约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，精密称定质量，超声处理 (功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再精密称质量，用甲醇补足失质量，用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取狼毒乙素、狼毒丙素3.00、3.90 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，摇匀，即得狼毒乙素、狼毒丙素标准贮备液。精密量取狼毒丙素贮备液5 mL，狼毒乙素贮备液5 mL，至10 mL量瓶中，即得对照品溶液。

2.4 线性考察 精密量取对照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、2.4、3.5 mL，分别加甲醇定容至10 mL。分别吸取上述对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，记录峰面积;以进样量 (μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得狼毒乙素的线性范围为0.000 3～0.21μg，回归方程为Y=6×106X+4.225 8，r=0.999 9;狼毒丙素的线性范围为0.003 9～0.273μg，回归方程为Y=2×106X+10.734，r=0.999 9。

2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液，分别含狼毒乙素0.010 5 mg/mL、狼毒丙素0.013 65 mg/mL，连续进样5次，测定峰面积，2种物质在此测定方法下，测得狼毒乙素峰面积的RSD值为0.012%，狼毒丙素峰面积的RSD值为0.037%。

2.6 稳定性试验 在上述色谱条件下，取同一供试品溶液，分别在保存0、2、4、6、12、24 h进行测定，测定峰面积，2种物质在此测定方法下，测得狼毒乙素峰面积的RSD值为1.11%，狼毒丙素峰面积的RSD值为1.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一月腺大戟药材 (亳州药材公司-1)粉末 (过三号筛)，按供试品制备方法，平行制备6份，进行测定，计算狼毒乙素、狼毒丙素的的含有量，RSD分别为1.30%、1.54%，表明该测定方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已测定的月腺大戟药材(亳州药材公司-1)粉末 (过三号筛)，共6份，各约1g，精密称定，分别精密加入狼毒乙素、狼毒丙素对照品，按照供试品溶液制备，测定含有量并计算加样回收率，结果见表1。

表1 狼毒乙素、狼毒丙素加样回收率结果(n=6)

2.9 样品测定 精密称取不同供应商、不同批次月腺大戟药材粉末各2.0 g(过三号筛)，按照2.2项供试品制备方法制备，以20 μL进样，测定色谱峰峰面积，根据标准曲线计算质量分数，结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核，结构上具有一定的相似性。结合文献报道［8-9］，实验通过使用DAD检测器，对被测物质进行了全波长扫描，考察了狼毒乙素、狼毒丙素最大吸收峰情况。结果表明，狼毒乙素的最大吸收峰在293 nm左右，狼毒丙素的最大吸收峰在288 nm左右。综合考虑，本实验选择的检测波长为290 nm，实际检测结果显示，效果较好。

表2 样品测定结果 (n=3)

3.2 流动相的选择 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核［10］，因母核上取代基的不同造成极性略有差异，实验经过多次调整梯度洗脱时流动相比例、体积流量、柱温、最终筛选出使各成分能够较好分离的色谱条件。

3.3 药材提取方法考察［11-12］实验采用单因素法，考察了水、甲醇、1%乙酸-95%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、70%甲醇不同提取溶剂对狼毒乙素和狼毒丙素提取效率的影响，结果显示甲醇提取效率较高;比较了回流、冷浸、超声3种提取方法，结果表明超声提取效果较好;比较了超声提取20、30、40 min的提取效果，结果表明随着超声时间的延长，提取效率提高，但是到达一定时间后，其提取效率不再提高，故选择超声提取30 min;比较了25、50、75倍提取溶剂对提取效率的影响，结果显示用50倍量提取液的提取效果较好。

致谢:承江苏省中国科学院植物研究所张涵庆研究员惠赠对照品并给予指导。

［1］高 橼，万赛罗，蔡永萍，等．月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究［J］．激光生物学报，2008，17(2):213-219．

［2］孟 娜，周守标，蒋继宏．月腺大戟(Euphorbia ebracteolata)根部提取物抑菌作用的测定［J］．生物学杂志，2005，22(4):16-18．

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［4］王文祥，丁杏苞．月腺大戟的化学成分研究［J］．中草药，1999，30(1):1-3．

［5］杜 娟，徐瑞军，崔 晞，等．月腺大戟水提物诱导P388白血病细胞的凋亡［J］．中国医院药学杂志，2007，27(4):454-458．

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［7］颜秉强，张永清．月腺大戟研究进展［J］．山东中医药大学学报，2008，32(5):432-435．

［8］谢演晖，严小红，王灿坚，等．RP-HPLC法测定月腺大戟中狼毒乙素的含量［J］．中药材，2010，33(4):568-570．

［9］赵奎君，徐国钧，金蓉鸾，等．HPLC法测定月腺大戟根中狼毒甲素及狼毒乙素的含量［J］．中草药，1995，26(2):66-67．

［10］张涵庆．月腺大戟根中有效成分乙素和丙素的结构研究［J］．植物资源与环境，1992，1(3):6．

［11］袁海建，贾晓斌，陈 彦，等．正交试验优选龙葵的提取工艺［J］．中成药，2009，31(1):120-122．

［12］袁海建，贾晓斌，陈 彦，等．不同产地龙葵药材中澳洲茄碱量的分析研究［J］．中草药，2008，39(5):772-774．