HPLC法测定西藏野生和人工种植喜马拉雅紫茉莉中葫芦巴碱

刘 青， 达瓦潘多， 央 美， 顿珠次仁， 仁 增， 索朗其美

(西藏藏医学院，西藏拉萨850000)

喜马拉雅紫茉莉 (巴朱)为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉 Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根［1］。该藏药具有温肾、益肾滋补、生肌、利尿、排石等功效，用于胃寒、肾寒、下身寒、阳萎浮肿等［1-3］，喜马拉雅紫茉莉作为藏药使用历史悠久，始见于《月王药珍》［4］，藏医药名著《四部医典》和《晶珠本草》均有记载［2-5］。对于紫茉莉属植物根中含有抗植物病毒、抗菌的蛋白成分、氨基酸、有机酸、豆甾醇、β-谷甾醇、葫芦巴碱、半乳糖、淀粉、树脂等和挥发油成分［6-11］早有研究报道。作为藏药药用的紫茉莉属植物喜马拉雅紫茉莉在临床应用范围广，临床上常见的十五味儿茶丸、巴桑母酥油丸、二十五味鬼臼丸、热巴罗布膏等剂型作为主要的原料之一，资源紧缺，属于藏药濒危物种之一。2003年由西藏藏医学院索朗其美教授主持的人工种植喜马拉雅紫茉莉作为西藏高原濒危藏药材人工种植栽培技术项目之一，并获得该种植技术的项目专利，于2006年顺利通过西藏自治区科技厅结题验收。为保证喜马拉雅紫茉莉用于临床品种的质量，对野生和人工种植喜马拉雅紫茉莉中葫芦巴碱［10］进行定量测定［11］。

1 仪器与材料

梅特勒AE200电子天平;岛津LC—20A液相色谱仪，配SPD—20AV紫外可见检测器;ASI0200BDT超声波清洗器 (250W，天津奥特赛恩斯仪器有限公司);UV—2100紫外可见分光光度计 (北京莱伯泰科技仪器有限公司)。乙酸、甲醇 (色谱纯)，乙腈 (色谱纯，Fisher公司);优普超纯水机 (蒸馏水自制)。葫芦巴碱 (中国药品生物制品检定所，批号:110813-200502)。喜马拉雅紫茉莉野生和人工种植品由西藏藏医学院研究所提供，经西藏藏医学院科研所索朗其美教授鉴定为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack VP-ODS色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)，柱温40℃;体积流量0.8 mL/min;检测波长265 nm。

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约1 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL，20℃超声处理 (功率250 W，频率55 kHz)40 min，静置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取葫芦巴碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含13.75 μg的溶液，即得。

2.4 系统适应性试验 取上述对照品溶液及供试品溶液，照2.1项下色谱条件，各进样10 μL，测得HPLC图谱，见图1。理论塔板数按葫芦巴碱峰计算不低于4 000。

2.5 线性关系的考察 精密配制系列质量浓度的葫芦巴碱对照 品 溶 液:3.44、13.75、31.43、55.00、110.00 μg/mL，分别精密进样10 μL，测定峰面积，以对照品质量浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，计算，得回归方程为:y=8.008 41×10－5x+1.702 816，相关系数R=0.999 8，表明葫芦巴碱在3.44～110 μg/mL范围内具有良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密量取葫芦巴碱对照品溶液10 μL(13.75 μg/mL)，连续进样 5次，测定其峰面积，RSD为1.43%。

2.7 稳定性试验 取样品 (批号2011092301)按2.2项方法制备，分别在0、2、4、6、10、12 h测定，结果葫芦巴碱质量分数的RSD为0.42%。表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取样品 (批号2011092301)样品6份，按2.2项制备，制得6份供试品溶液，按样品测定法测定峰面积，测得供试品中葫芦巴碱平均质量分数为0.21 mg/g(RSD=1.8%，n=6)，表明本法重复性较好。

图1 高效液相色谱图

2.9 回收率试验 采用加样回收法，精密称取适量的已测知含有量的样品 (葫芦巴碱质量分数为0.260 4 mg/g;批号2011092302)6份，分为低、中、高3组，分别精密加入葫芦巴碱对照品溶液 13.75 μg/mL、20 μg/mL、25.88 μg/mL各1 mL，按2.2项制样并测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.10 样品测定 取野生及人工种植药材 (各3份)，按上述色谱条件测定，计算其中葫芦巴碱的质量分数，结果见表2。

表2 样品测定结果 (n=6)

3 讨论

根据参考文献，宋粉云等［12］采用HPLC法测定了紫茉莉根中葫芦巴碱。结合多次的实验条件摸索，比较不同比例 的 乙 腈-0.03% 乙 酸 (20∶80)、乙 腈-0.03% 乙 酸(10∶90)、乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)等流动相系统对葫芦巴碱峰与杂质峰的分离度、保留时间、理论板数等的影响。发现流动相乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)能保证葫芦巴碱峰与杂质峰的分离度、理论板数均达到较好;比较了葫芦巴碱于265 nm及214 nm处的吸光度值，结果在265 nm处有较高的吸收。

现代药理研究表明，葫芦巴碱是一种两性化合物，以内盐的形式存在。葫芦巴碱不但具有抗肿瘤的活性，也是一种具有降低血糖功效的活性物质［13］，针对上述药理作用，人工种植喜马拉雅紫茉莉中葫芦巴碱的量高于野生喜马拉雅紫茉莉中葫芦巴碱的量。对于其它的主要成分，将进一步的比较和研究，为藏药喜马拉雅紫茉莉在临床上合理、有效、安全使用提供理论依据。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国卫生部药品标准藏药．第一册［S］．1995:104．

［2］中国科学院西北高原生物研究所．藏药志［M］．西宁:青海人民出版社，1991:461．

［3］青海省药品检验所，青海省藏医药研究所．中国藏药:第一卷［M］．上海:上海科学技术出版社，1996:303．

［4］卫生部药品生物制品检定所．中国民族药志:第二卷［M］．北京:人民卫生出版社，1990:348．

［5］宇妥·元丹贡布．四部医典［M］．上海:上海科学技术出版社，1987:165．

［6］李光喜，杨培全．紫茉莉属药用植物研究进展［J］．广东医药学院学报，1994，10(4):251-253．

［7］Ahmad M S，Ranf A，Mustafa J，et al．An 8-hyydroxy octadeca-CIS-11，14-dienoic from Mirabilis jalapa seed oil［J］．Phyto Chem，1984，23:2247-2249．

［8］危 英，杨小生，郝小江，等．紫茉莉根的化学成分［J］．中国中药杂志，2003，28(12):1151-1152．

［9］Ghosh T K，Rao C C．Some structural features of the Dglucan from the seed of Mirabilis jalapa［J］．Carbohydr Res，1981，90:243．

［10］王 琳，杨德成，江金霖，等．紫茉莉属植物的化学成分和药理活性的研究进展［J］．中国民族民间医药，2010，19(7):31-34．

［11］巩 江，王聪聪，倪土峰，等．国产紫茉莉属植物药学研究［J］安徽农业科学.2009，37(13):5959-5960．

［12］宋粉云，张德志，钟远香，等．HPLC法测定紫茉莉根中葫芦巴碱的含量［J］．中药新药与临床药理，2005，16(3):189-191．

［13］赵怀清，曲 燕，王学娅，等．葫芦巴碱的HPLC法测定及药代动力学研究［J］．药学学报，2003，38(4):279-282．