抗人B淋巴细胞单克隆抗体清除中国恒河猴体内B淋巴细胞效果观察

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，不仅可以通过合成与分泌抗体介导体液免疫应答，还能分泌细胞因子参与免疫调节［1］。B淋巴细胞在抗SIV/HIV感染中也有一定的免疫保护作用，但因机体内影响因素众多，导致在研究其具体功能时受到了一定的干扰，所以应用B细胞敲除的方法反向研究B淋巴细胞在SIV/HIV感染中的作用，具有非常重要的意义。鉴于目前缺乏去除恒河猴体内B淋巴细胞的试剂，本研究拟通过一次性静脉滴注抗人B淋巴细胞单克隆抗体去除恒河猴 B淋巴细胞，评估并测定中国恒河猴外周血、外周淋巴结及十二指肠肠黏膜组织中B淋巴细胞敲除效果及转归情况，为深入探讨B淋巴细胞SIV/HIV感染中的作用，与病毒的复制以及疾病进程的关系，提供基础实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康中国恒河猴2只，购自北京协尔鑫公司［SCXK(京)2005-2005］，体重3.2kg～3.5kg。间接免疫荧光法(IFA)检测排除相关慢病毒——猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1)、猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。

1.2 试剂

1.2.1 利妥昔单抗注射液(rituximab，50mg/kg)：商品名美罗华(MabThera，Cat No.B6094)，是Roche公司生产的抗人B淋巴细胞单克隆抗体。

1.2.2 流式抗体：Percp anti-human CD3(BD，Cat No.552851)，FITC anti-human CD4(Biolegend，Cat No.317408)，PE anti-human CD8(Biolegend，Cat No.301008)，APC anti-human CD20(Biolegend，Cat No.302310)。

1.3 给药方式

中国恒河猴2只，G1205和 G1206，按50mg/kg剂量下肢静脉滴注利妥昔单抗注射液。静脉滴注过程中注意速度(约60滴/min，全部过程(1～2) h完成)，同时注意预防过敏等不良反应的发生。

1.4 组织细胞取材和预处理

1.4.1 外周血的采集：静脉滴注前及静脉滴注后1、4、7、10、14、18、21、25、28、42、56d采集实验猴EDTA抗凝血进行流式检测。

1.4.2 外周淋巴结采集及细胞分离：静注前及静注后7、14、21、28、42、56d采集腹股沟淋巴结。在生物安全柜中将淋巴结的包膜以及脂肪组织剔除，冲洗干净、剪碎，置于70μm的尼龙细胞筛上轻轻研磨，用含5%胎牛血清及5%双抗(10000单位/mL青霉素和10000μg/m L链霉素)的RPM I 1640培养基冲洗。离心并收集细胞沉淀，调整细胞浓度至1×106个/m L。

1.4.3 肠道组织采集及细胞分离：动物在行内窥镜前禁食8h～12h，给予复方氯胺酮注射液(生理盐水1：5稀释后0.1m L/kg)肌内注射麻醉，然后使用Olympus内窥镜(型号GIF-160)及配套设备，在十二指肠降段取4～6块活检组织［2］。将新鲜肠道组织置于70μm的尼龙细胞筛上轻轻研磨，并用含5%胎牛血清以及5%双抗的RPMI 1640培养基冲洗。离心并收集细胞沉淀，调整浓度至1×106个/m L。

1.5 流式抗体检测

将EDTA抗凝血和新鲜制备的淋巴细胞进行流式抗体检测。分别取50μL的EDTA抗凝血或淋巴细胞悬液(106个/50μL)，依次加入流式抗体—CD3(percp)、CD8(PE)、CD4(FITC)和CD20(APC)。室温避光作用15min后(全血检测管需另加入终浓度10%的红细胞裂解液，4℃作用10min)，重悬于pH 7.2PBS中，FACS仪上分类计数［3］。

1.6 统计学方法

使用Flowjo version 7.6进行流式数据分析，作图及统计分析由Graphpad Prism 5完成。

2 结果

2.1 静脉滴注利妥昔单抗注射液后外周血中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化

静脉滴注利妥昔单抗注射液作用24h后，恒河猴G1205和G1206外周血中B淋巴细胞的百分比即从正常的50%左右降低到0%，绝对数也从第0天的240cells/μL降到了0，去除率达到100%，去除时间维持约14d。28d时 B淋巴细胞的百分比

恢复到4～8%左右，绝对数也逐渐恢复到10～30cells/μL。到56d时，已接近实验前的水平(图1A，B)。在 B淋巴细胞成功去除的同时，CD4+T及CD8+T淋巴细胞波动平稳，CD4+T淋巴细胞的波动范围在60～70%之间，CD8+T淋巴细胞的波动范围在20～40%之间(图1C，D)。

2.2 静脉滴注利妥昔单抗注射液后腹股沟淋巴结中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化

实验前，G1205和G1206两只恒河猴腹股沟淋巴结中B淋巴细胞比例为20%～30%，利妥昔单抗注射液静脉滴注后7 d，B淋巴细胞比例为0%，去除率达到100%，到第21天之前，B淋巴细胞升高幅度很小，恢复到3%左右。到第28天时，B淋巴细胞比例较前明显上升，56d时，G1206号猴B淋巴细胞恢复接近正常值，G1205号猴恢复到15%左右(图2A)。

图1 静脉滴注利妥昔单抗注射液后外周血中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化注：A：CD20+细胞的百分比；B：CD20+细胞的绝对数；C：CD4+T细胞的百分比；D：CD8+T细胞的百分比Fig.1 Changes of the concentrations of B-and T-cell subsets in peripheral blood afterintravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The absolute numbers of CD20+cells；C：The percentage of CD4+T-cells；D：The percentage of CD8+T-cells

图2 静脉滴注利妥昔单抗注射液后腹股沟淋巴结中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化注：A：CD20+细胞的百分比；B：CD4+T细胞的百分比；C：CD8+T细胞的百分比；LN：淋巴结Fig.2 Percentage of B-and T-cell subsets in the inguinal lymph nodes after intravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T-cells；C：The percentage of CD8+T-cells.LN：inguinal lymph nodes

在静注利妥昔单抗注射液之前G1205和G1206两只恒河猴的腹股沟淋巴结中的CD4+T淋巴细胞

约75%左右，静脉滴注后第14天时稍有下降，约降低到60%左右，随后的两个月内都较平稳，并一直维持在60%～70%之间；其CD8+T淋巴细胞在静脉滴注利妥昔单抗注射液之后的第14天时由第0天的15～20%上升到了30%左右，之后的两个月内CD8+T淋巴细胞的水平维持在 25% ～35%之间(图2B，C)。

2.3 静脉滴注利妥昔单抗注射液后十二指肠黏膜固有层中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化

两只实验猴在实验前十二指肠黏膜固有层中B淋巴细胞比例约为5%～10%。静脉滴注利妥昔单抗注射液后7 d，降低到1.0% ～1.5%，去除率约80% ～90%。恒河猴 G1205一直维持这种状态至观察结束的56d，G1206维持到28d，随后升高，42d时达到30%，56d时下降到20%(图3A)。

十二指肠黏膜固有层中的CD4+T细胞只在第14天时由第7天的15%上升到29% ～36%之间，其余时间点的CD4+T细胞的水平未见明显波动，均维持在10%～20%之间，其CD8+T细胞的水平与CD4+T细胞相反，在第14天时，两只恒河猴的CD8+T细胞均有所下降，到第21天时，其 CD8+T细胞上升到60%～70%之间(图3B，C)。

图3 静脉滴注利妥昔单抗注射液后十二指肠黏膜固有层中B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化注：A：CD20+细胞的百分比；B：CD4+T细胞的百分比；C：CD8+T细胞的百分比；LP：指肠黏膜固有层Fig.3 Changes of the percentages of B-and T-cell subsets in the duodenal biopsy specimens after intravenous injection of rituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T cells；C：The percentage of CD8+T cells；LP：Duodenal biopsy specimens

3 讨论

B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，不仅可以通过合成与分泌抗体介导体液免疫应答，还能通过分泌细胞因子参与免疫调节［1］。以往研究表明，与正常HIV-1感染者相比，B淋巴细胞缺失患者的病毒载量要高2个数量级 (1.7 log10)［5］。Miller等人也在实验中发现，敲除了B淋巴细胞的恒河猴与正常感染SIV的恒河猴相比较，不仅能使病毒载量升高，而且发展成为 AIDS的时间也会缩短［6］。这些都充分说明，B淋巴细胞在控制SIV/HIV病毒感染中发挥着重要的作用。但因机体内影响因素众多，导致在研究其具体功能时受到了一定的干扰。国外近几年已经开始利用利妥昔单抗开展AIDS的研究工作，目的在于利用B淋巴细胞缺失的动物模型，反向研究在B淋巴细胞缺失的情况下，SIV/HIV感染时机体免疫水平和病毒水平的变化，从而间接地了解B淋巴细胞的功能。目前这项工作在国内基础研究领域还是空白。

本研究使用抗人B淋巴细胞单克隆抗体(利妥昔单抗注射液)，通过静脉滴注的方式，观察一次性给药后中国恒河猴外周血及淋巴组织B淋巴细胞敲除情况。在长达两个月的观察期内，系统测定了外周血、外周淋巴结及肠黏膜固有层中B淋巴细胞的比例变化情况。结果表明，利妥昔单抗能够降低甚至完全去除恒河猴血液、腹股沟淋巴结中的B淋巴细胞，其外周血和淋巴结中的B淋巴细胞的去除率达到100%。十二指肠肠粘膜固有层中B细胞的去除率也能达到80%以上，且能持续28d甚至更长时间，这个结果显示B细胞在十二指肠黏膜中的清除时间比外周血和淋巴结中的清除时间都更持久。这一结果与 Gaufin等人的研究基本相同［7］。不同的是，近几年国外在开展此项研究时，基本上是采取连续给药的方式。Gaufin在对非洲绿猴进行B淋巴细胞敲除时，就采取每21d静注 Rituximab一次的方案，直到SIVagm感染后的第184天［7］。本研究没有使用上述方法，只是进行了单次滴注，主要是为了了解中国恒河猴在静脉滴注妥昔单抗注射液后各个组织中B淋巴细胞的去除效果及转归规律，得到第一手的基础数据，为今后深入开展B淋巴细胞功能研究提供依据，以便根据具体的研究目的制订相应的实验方案。

在静脉注射利妥昔单抗注射液之前，我们分别检测了血液，腹股沟淋巴结以及十二指肠黏膜组织中的B细胞和T细胞亚群的变化，各组织中CD20+B淋巴细胞的百分比均与之前文献报道的一致［7］。血液和淋巴结中，CD4+T淋巴细胞在60%～80%之间，CD8+T淋巴细胞在20～40%之间；而在十二指肠黏膜固有层中 CD4+T淋巴细胞的比例却只有15% ～40%，CD8+T淋巴细胞比例的波动范围较大，在35% ～70%之间。肠黏膜固有层中 CD4+T淋巴细胞的比例与血液和淋巴结相比较含量最低，这一结果与本实验室长期研究的结果相符合［3］。但总的来说，在成功去除B淋巴细胞的情况下，T淋巴细胞变化较平稳，保持了体内的基本稳定状态，在比例上没有过多受B淋巴细胞去除的影响。也有研究表明，在小鼠体内敲除B淋巴细胞后，经逆转录病毒感染后并未出现表型和功能异常的T细胞，这就保证了在B淋巴细胞去除的情况下，CD4+T及CD8+T淋巴细胞能维持相对稳定的功能。这一结果对我们研究B淋巴细胞的功能方面是有益处的。

总之，无论是血液，淋巴结还是十二指肠黏膜固有层，抗人B淋巴细胞单克隆抗体(利妥昔单抗注射液)均能有效去除恒河猴体内B淋巴细胞，并且在成功敲除 B淋巴细胞的情况下，CD4+T及CD8+T淋巴细胞无明显波动，维持在一个稳定的水平。

［1］何维.医学免疫学(第2版)［M］.北京：人民卫生出版社.2010：322-327.

［2］刘颖，朱华，丛喆，等.SHIV感染恒河猴十二指肠黏膜活检组织病理学观察［J］.中国比较医学杂志，2009，19(3)：18-31.

［3］熊竞，刘克剑，吴芳新，等.健康中国恒河猴各淋巴组织中T淋巴细胞表型及分布［J］.中国畜牧兽医， 2012，39 (2)：86-91.

［4］Tasca S，Zhuang K，Gettie A，et al.Effect of B-cell depletion on coreceptor switching in R5simian-human immunodeficiency virus infection of rhesus macaques［J］.J Virol，2011，85(7)：3086-3094.

［5］Huang KH，Bonsall D，Katzourakis A，et al.B-cell depletion reveals a role for antibodies in the control of chronic HIV-1infection［J］.Nat Commun.2010，1：102.doi：10.1038/ncomms1143.

［6］Miller CJ，Genescà M，Abel K，et al.Antiviral antibodies are necessary for control of simian immunodeficiency virus replication［J］.J Virol，2007，81(10)：5024-5035.

［7］Gaufin T，Pattison M，Gautam R，et al.Effect of B-cell depletion on viral replication and clinical outcome of simian immunodeficiency virus infection in a natural host.J Virol，2009，83(20)：10347-10357.