河豚毒素中和性单抗的制备、鉴定及TTX检测方法的建立

郭建巍，王珍光，张 云，张雅芳，赵强元，马 聪

(海军总医院检验科，北京 100048)

河豚毒素 (tetrodotoxin，TTX)是一种重要的海洋生物毒素，广泛存在于海洋生物和陆栖等众多生物中，并可通过食物链富集等途径污染其它水产品，TTX中毒屡有发生，死亡率达40%以上。作为一种潜在的军用毒剂，TTX已被列入国际生物安全公约清单［1］。目前针对 TTX中毒，国内外还没有适用于人体的专用特效药［2，3］，因此建立和发展具有自主知识产权的抗体制剂及检测方法具有非常重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

河豚毒素(购于河北省水产研究所)；HT、HAT、PEG1500购自Sigma公司；18g～20g Balb/c小鼠由海军总医院实验动物中心提供；新生小牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所；HRP(RZ≥3.1)及四甲基联苯胺(TMB)为Sigma公司产品；HRP标记的羊抗小鼠抗体(GAM-HRP)由本室制备；Protein A层析柱购自 Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原的制备：河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)15mg溶于pH 5.0的柠檬酸缓冲液中，缓慢滴加到15mg KLH/0.01mol/L PBS溶液中，调pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室温反应1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃透析48h，检测蛋白定量，既得TTX-KLH复合物即免疫原，分装后-20℃保存。1.2.2 检测用抗原的制备：河豚毒素10mg溶于pH 5.0的柠檬酸缓冲液中，将此溶液缓慢滴加到10mg BSA/0.01mol/L PBS溶液中，调pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室温反应1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃进行透析48h，既得 TTX-BSA复合物，分装后-20℃保存。

1.2.3 抗 TTX单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建、筛选和鉴定：选用4～6周龄的雌性 Balb/c小鼠6只，分别用12.5μg TTX-KLH对小鼠腹股沟皮下多点注射免疫，每3周免疫1次，共免疫4次，常规方法融合。用 TTX-BSA间接 ELISA筛选 ，阳性细胞反复亚克隆直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。于Balb/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水，protein A sepharose CL4B亲和柱纯化，SDS-PAGE、间接ELISA鉴定。

1.2.4 抗TTX单抗的中和活性测定：选用4～6周龄的昆明小鼠100只，雌雄各半，将TTX用双蒸水溶解，原液浓度为1mg/m L，用常规实验方法检测TTX的LD50。先将1mg/m L的单抗(对照组用蒸馏水)注入小鼠腹腔，然后注入1.62μg/m L的TTX溶液，72h动态观察并记录小鼠的生存状态。

1.2.5 TTX ELISA检测方法的建立：以40μg/m L BSA-TTX包被酶标板，10%FCS PBS过夜封闭。将TTX用 PBS倍比稀释后分别加入包被好的酶标板中，每孔50μL，再加入5μg/m L TTX-McAb每孔50μL，37℃ 1h，洗板后加入1：2000抗鼠二抗，37℃45m in后洗板TMB显色，酶标仪测A450。

2 结果

2.1 TTX单克隆抗体的纯化

用protein A sepharose CL 4B亲和柱对所获得的2株单抗腹水进行了纯化，获得了高纯度的IgG如图1所示。

图1 TTX单抗的Protein A sepharose CL 4B纯化结果1.穿透峰；2.洗脱峰Fig.1 Purification results of TTX McAb with protein A sepharose CL 4BNote：1.Transmission peak；2.Elution peak

2.2 纯化后TTX单抗的SDS-PAGE鉴定

将protein A sepharose CL 4B亲和柱纯化的单抗体行 SDS-PAGE电泳，结果显示抗体纯度大于95%(图2)。

图2 2株TTX单抗纯化后SDS-PAGE结果1.5E4，2.5E7，3.蛋白质Marker，a：重链，b：轻链Fig.2 SDS-PAGE results of purified TTX McAbs Note：1.5E4；2.5E7；3.Protein marker；a：Heavy chain；b：Light chain

2.3 纯化后TTX单抗的间接EL ISA鉴定

用TTX-BSA以40μg/m L包被酶标板，常规间接ELISA检测，结果显示，单抗5E7的结合能力高于5E4(图3)。

图3 2株TTX单抗的活性检测Fig.3 Detection of the activity of the anti-TTX McAbs

2.4 TTX单抗的中和活性测定

将2μg/m L浓度的TTX 0.5m L分别注入10只昆明小鼠腹腔后，小鼠于30m in内全部死亡；分别用2μg/m L、1.8μg/m L、1.6μg/m L、1.4μg/m L、1.48μg/m L、0μg/m L浓度的TTX测得 TTX的LD50为1.62μg/m L。将1mg/m L的TTX单抗(对照组用蒸馏水)0.5mL与1.62μg/mL TTX 0.5m L混合后注入小鼠腹腔，随时观察实验和对照组(各10只)小鼠的状况，24h后通过不断追加2μg/m L TTX，每次0.2m L/只，每30min观察1次，直至对照组小鼠全部死亡，测得当对照组小鼠全部死亡时，即2LD50时，TTX单抗对实验小鼠的保护率为50%。

2.5 TTX的ELISA检测结果

用中和性单抗与TTX竞争后加入酶标二抗，通过TMB显色间接测定TTX浓度，从图4可以看到，TTX浓度与显色深浅成反比，竞争ELISA测得TTX的最小浓度为1.56μg/m L。

图4 用竞争ELISA检测TTXFig.4 Detection of TTX by competitive ELISA

3 讨论

TTX是高毒的非蛋白神经性海洋生物毒素，人畜中毒死亡率高，目前尚无特效抗毒药。TTX在军事上也是潜在的化学战剂和实施恐怖活动的毒剂。研制TTX的中和性抗体及检测方法，在平时和战时都具有重要的理论和现实意义。

TTX为氨基全羟基喹唑啉化合物，毒性强，分子量小，分子式为C11H17N3O8，主要通过阻滞钠离子通道，阻断神经肌肉电信号传导，能够引起肌肉麻痹和呼吸麻痹，导致人畜死亡［4-6］。作为典型的小分子半抗原(M r=319)，TTX本身无免疫原性。我们用甲醛将TTX与大分子的嗜孔血蓝蛋白偶联成TTX-KLH，免疫BALB/c小鼠，用TTX-BSA作为检测抗原，通过将TTX与不同蛋白交联，避免了非特异性免疫蛋白的干扰，取得了较好的免疫应答及检测结果［7］。

昆明小鼠同时腹腔注射LD50剂量的TTX和抗TTX的单抗后，以TTX攻击。结果表明，两株单抗对染毒动物具有一定的保护效果，对2LD50及致死剂量TTX攻击小鼠的保护率为50%，显示出良好的抗毒效果。

用中和性抗体作为拮抗剂应用的一个最大问题就是，TTX分子量非常小，进入机体后能够迅速作用于把靶器官，而与之相比，抗体分子量大，穿透力弱，与毒素的结合需要一个过程，要在短时间内阻断毒素的作用具有一定难度。保护实验结果充分说明了这一点，这也是今后其它小分子化合物毒素拮抗剂研究中所面临的问题。

尽管如此，在目前TTX中毒无任何特效抗毒药的情况下，我们的实验结果无疑展现了希望。基于TTX的中和性抗体，我们建立了检测 TTX的竞争ELISA方法，此方法检测TTX的灵敏度为1.56μg/m L，与传统ELISA的检测灵敏度相比，仍具一定差距，需要进一步完善。鉴于TTX的小分子特性及与靶器官的快速结合，阻止其与钠通道靶位结合的能力主要决定于亲和力及拮抗剂分子量的大小。下一步的工作将是继续研制高亲和力的优质 TTX小分子拮抗剂，以便实现对TTX中毒的有效保护和急救治疗；完善基于TTX中和性抗体的高灵敏度免疫检测方法，对TTX的快速侦检具有重要意义。

［1］Chang FC，Bauer RM，Benton BJ et al.4-Aminopyridine antagonizes saxitoxin-and tetrodotoxin-induced cardiorespiratory depression［J］.Toxicon.1996，34(6)：671-90.

［2］Chowdhury FR，Nazmul Ahasan HA，Mamunur Rashid AK，et al. Tetrodotoxin poisoning： a clinical analysis， role of neostigmine and short-term outcome of 53cases［J］.Singapore Med J.2007，48(9)：830-833.

［3］宫庆礼，崔建洲.河豚鱼的安全食用研究［J］.卫生研究，2003，32(4)：346-348.

［4］Kao CY.Tetrodotoxin，saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomena.Pharmacol Rev［J］.1966，18(2)：997-1049.

［5］宋杰军，毛庆武.海洋生物毒素学［M］.北京：北京科学技术出版社，1996：162-181.

［6］Chang FC， Benton BJ， Salyer JLet al. Respiratory and cardiovascular effects of tetrodotoxin in urethane-anesthetized guinea pigs［J］.Brain Res.1990，528(2)：259-268.

［7］Kawatsu K，Hamano Y，Yoda T et al.Rapid and highly sensitive enzyme immunoassay for quantitative determination of tetrodotoxin［J］.Jpn J Med Sci Biol.1997，50(3)：133-150.