亚胺培南或美罗培南联合利福平降低不动杆菌防耐药突变浓度的体外研究

马慧敏，胡立芬，叶 英，朱玉林，李家斌

(1.安徽医科大学第一附属医院感染科，2.安徽省细菌耐药监测中心，3.安徽医科大学细菌耐药研究所，4.安徽医科大学第一附属医院药剂科，5.国家中医药管理局中药化学三级实验室，安徽合肥 230022)

不动杆菌(acinetobacter)是医院感染最常见的条件致病菌之一，广泛分布于自然界、人体表面及体内。碳青霉烯类抗菌药物是治疗不动杆菌的王牌药物，但随着碳青酶烯类抗菌药物在临床的广泛使用，在抗生素的选择压力下，耐碳青酶烯类不动杆菌日趋增多，如何防止耐药的进一步蔓延是临床上治疗不动杆菌感染亟待解决的问题。近年耐药突变选择窗(mutant selection window，MSW)理论的提出［1］为抑制耐药问题提供了新的思路和方法。防耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC)是指防止耐药突变菌株被选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度。它代表一个严格限制耐药突变株选择的抗菌药物浓度阈值，可用于评价药物的抗菌活性，反映药物抑制耐药突变菌株的选择能力。目前关于碳青酶烯类联合利福平对不动杆菌的MPC影响研究尚未见报道。为此本研究观察亚胺培南西司他丁(imipenem and cilastatin，IMP)或美罗培南(meropenem，MER)单用及分别与利福平(rifampicin，RFP)联合应用对不动杆菌的MPC影响，探讨联用抗菌药物降低MPC、缩小MSW的规律，为临床合理联用现有抗菌药物、防止耐药菌的产生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 安徽省细菌耐药监测中心2010年收集的临床分离标本。选取其中16株对亚胺培南、美罗培南均敏感的不动杆菌临床分离株。

1.2 菌株鉴定 不动杆菌的鉴定以16S rDNA序列进行分类鉴定。正向引物27F:5'-AGAGTTTGATC (C/A)TGGCTCAG-3'(对应于E.coil 16S rDNA序列的第8～27个碱基位置)，反向引物 1492R:5'-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3'(对应于E.coil 16S rDNA的第1 492～1 510个碱基位置)。PCR扩增产物经电泳检测后直接交由上海生工生物工程技术公司进行纯化和序列测定。运用Blast程序与数据库中已存在的不动杆菌16SrDNA序列进行相似性比较分析。

1.3 抗菌药物与培养基 IMP为杭州默沙东制药产品;MER为日本住友制药产品;RFP为沈阳双鼎制药产品。M-H培养基购自英国Oxiod公司。

1.4 实验仪器 恒温振荡培养箱(国胜仪器厂，江苏);细菌比浊仪(Oxiod，英国);32R低温离心机(Hettich，德国);多点接种仪(AQS Manufacturing公司，英国)。

1.5 最低抑菌浓度测定

1.5.1 测定单独应用时的MIC 按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2010年标准［2］采用琼脂二倍稀释法测定IMP、MER与RFP 3种抗菌药物单独用药时的MIC并判断结果。

1.5.2 测定联合应用时的MIC 采用简化棋盘法测定IMP、MER分别与RFP联用时的MIC。

1.5.3 计算部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)指数 FIC指数 =A药联合时的MIC/A药单用时的MIC+B药联合时的MIC/B药单用时的MIC。

1.5.4 判定标准 FIC指数≤0.5为协同作用;0.5＜FIC指数≤4为无关作用;FIC指数＞4为拮抗作用。判定标准参照文献［3］。

1.6 防耐药突变浓度(MPC)的测定［4-5］

1.6.1 含单药琼脂平板的配制 分别配制IMP、MER、RFP的MH琼脂平板，以IMP、MER、RFP各自的MIC为最低浓度，通过二倍稀释法配制1×MIC，2×MIC，4×MIC，8×MIC…，多个浓度系列的琼脂平板，使药物终浓度分别为IMP:0.125、0.25、0.5、1、2、…、128 mg·L-1，MER:0.125～128 mg·L-1，RFP:2～1 024 mg·L-1，每个浓度4个平板。

1.6.2 含两药琼脂平板的配制 以IMP和MER的MIC、MPC为基准，采用二倍稀释法配制含IMP和MER与RFP混合的MH琼脂平板。具体方法:分别精密量取1 ml不同稀释倍数浓度的IMP或MER+1 ml 80.0 mg·L-1RFP(RFP推荐给药剂量下人体平均血药浓度为4.0 mg·L-1，见文献［6］)+ 18 ml MH培养基，在90 mm平皿中混匀，配制成一系列不同浓度梯度的含两药平板，最低浓度为IMP和MER的MIC，最高浓度为IMP和MER的单药MPC，每个浓度4个平板。冷却后置37℃孵箱中以除去琼脂表面水分。

1.6.3 菌悬液制备 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于20 ml MH肉汤中37℃120次/分震荡过夜培养，3 000 r·min-1离心后弃上清，再悬浮在200 ml MH肉汤中，震荡培养6 h，3 000 r ·min-1离心弃上清，调整菌液浓度为3×1010CFU ·ml-1。

1.6.4 MPC的测定 取100 μl 3×1010CFU·ml-1菌液均匀涂布于含不同浓度药物的MH平板上，每个浓度4个平板，使每个药物浓度的细菌接种量为1.2×1010CFU。37℃培养72 h，以4个平板均无细菌生长的最低药物浓度为MPC。对含单药琼脂平板的测定为单药MPC，对含两药琼脂平板的测定即为联合用药后的MPC。对接近MPC药物浓度筛选出来的菌株接种于无药物的MH平皿，传代2次后再接种于原筛选药物浓度的平板上，以确定其是耐药突变株。以上实验重复2次，取其均值。

1.7 统计学分析 数据分析采用SPSS11.0统计软件对各组数据进行非参数检验。

2 结果

2.1 细菌鉴定结果 鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)8株;琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5株;醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)3株。

2.2 抗菌药物对16株不动杆菌的MIC值 16株不动杆菌对IMP、MER均敏感，MIC值范围均为0.125～0.5，对RFP的MIC值范围为2～4，见Tab 1。

Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 16 strains of Acinetobacter(mg·L-1)

2.3 联合药敏 IMP、MER分别与RFP联用后以无关作用为主，未见拮抗作用，协同作用所占的比例分别为25%(4/16)和6%(1/16)。如Tab 2所示。

Tab 2 FICs of imipenem or meropenem combination with rifampicin against 16 strains of Acinetobacter

2.4 抗菌药物单用及联合使用对不动杆菌的MPC和SI值 RFP单用对16株不动杆菌的MPC均＞1 024 mg·L-1。IMP或MER单用对16株不动杆菌的选择指数(selectiveity index，SI=MPC/MIC)均为16～128;分别与RFP联合使用SI均下降为1～32， IMP、MER单用对16株不动杆菌的MPC均为8～32，与RFP联合使用MPC分别下降为0.25～8和0.5～8。见Tab 3。

Tab 3 MPCs(mg·L－1)and SIs for imipenem and meropenem alone and in combination with rifampicin respectively against 16 strains of Acinetobacter

3 讨论

不动杆菌可以引起多种医院感染，具有多重耐药性，全世界范围内包括中国在内的多个国家的医院已经出现多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant acinetobacter baumanni，MDR-Ab)的暴发和流行。MDR-Ab治疗困难，病死率高，是目前临床治疗的难题。不动杆菌对一线药物碳青霉烯类的耐药率已从2003年的4.5%上升至2008年的48.1%～49.3%［7-8］。从MSW理论［1］来看:不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率之所以在短时间内迅速上升，可能是由于体内碳青霉烯类药物浓度处于不动杆菌的MIC和MPC之间，导致耐药突变株被选择性富集扩增，从而产生耐药。MPC是MSW的上限，当药物浓度高于MPC时，病原菌必须同时发生两次或更多次耐药突变才能生长，这样出现耐药突变体的概率将很低。Credito等［9］也提出当碳青霉烯类药物浓度达到MPC以上时，才可能有效防止耐碳青酶烯类药物突变体的产生，并测定了25株鲍曼不动杆菌临床分离株对IMP的MPC50和MPC90值分别为4 mg·L-1和 64 mg·L-1，对 MER的 MPC50和MPC90值分别为8 mg·L-1和128 mg·L-1。这与本研究显示的16株敏感不动杆菌对IMP和MER的MPC均为8～32 mg·L-1的结果稍有不同。这可能与上述25株鲍曼不动杆菌中包括部分碳青霉烯中介菌株有关。结合药代动力学参数分析，按临床推荐药物剂量0.5 g单次静脉输注后，IMP和MER血浆峰浓度Cmax分别为35 mg·L-1和26 mg·L-1，本研究中有10株不动杆菌IMP的MPC值是8和16 mg·L-1，11株菌MER的MPC值也是8和16 mg· L-1，都低于血浆峰浓度Cmax，因此对于这些菌单独应用碳青酶烯类药物可能会限制耐药突变体的产生。然而还有6株菌IMP的MPC值是32 mg· L-1，5株菌MER的MPC值是32 mg·L-1，都接近血浆峰浓度，而且IMP和MER在脑脊液等组织中的浓度低于血药浓度［10］，因此感染部位的药物浓度往往落在MSW之内，若要增大给药剂量，可能产生较严重的副作用，所以此类药物单独使用不能完全限制耐药突变体富集。

MSW理论提出了一种限制耐药突变体产生的方法:当2种不同作用机制的抗菌药物联合应用，并同时处于各自的MIC以上时，细菌需要同时发生2种耐药突变才能生长［11］，从而关闭或缩小MSW，防止耐药菌产生。孙恩华等［12］报道美罗培南、头孢他啶分别与环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素联合可以降低对铜绿假单胞菌的SI。梅清等［5］应用万古霉素联合利福平或磷霉素可以缩小耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药突变选择窗。近年来利福平治疗多重耐药不动杆菌(MDR-Ab)的研究多有报道，体外和动物实验均证实利福平治疗MDR-Ab有效［13］，Pachón-Ibáñez等［14-15］的研究证明RFP联用亚胺培南对多重耐药及泛耐药不动杆菌引起的动物肺炎及脑膜炎模型疗效较好。且体外联合药敏结果显示，IMP或MER联合RFP协同作用分别为25%和6%，以无关作用为主，无拮抗作用。这与Kiratisin等［16］报道IMP和MER分别与RFP对15株非多重耐药不动杆菌联合用药，协同作用所占比例均为6.7%，均无拮抗作用的结果接近，因此碳青霉烯类抗菌药物与RFP联合用药具有可行性。本研究中IMP或MER与RFP联合使用后，MPC由单用时的8～32，分别下降为0.25～8和0.5～8，SI均由单用时的16～128下降为1～32，均下降了2～32倍，甚至出现了关闭MSW的情况，2号菌株关闭了IMP的MSW。4号菌株关闭了MER的MSW。本研究结果证实了IMP或MER与RFP联合使用能缩小甚至关闭MSW，减少耐碳青霉烯不动杆菌的出现。

本研究初步探讨了碳青霉烯类抗菌药物与RFP联合对不动杆菌MPC的影响，证实此种联合方案能降低IMP和MER的MPC，缩小甚至关闭MSW，能有效防止耐药突变体的富集。这为临床合理应用碳青酶烯类抗菌药物治疗不动杆菌感染，减少耐碳青酶烯类不动杆菌突变体的出现提供了理论依据。由于体内环境复杂、影响因素多，体内药物浓度不恒定，与体外研究存在一定的差异，因此尚需进行动物和临床实验进一步验证联合用药时药物代谢动力学与耐药突变体选择的关系。

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