银杏叶提取物对大鼠糖尿病性白内障防治作用的研究

刘 玲，鲁 茜，杨婷婷，张 帆，尹家乐，杜 蕾，印晓星

(徐州医学院药学院1.新药与临床应用实验室，2.临床药理学教研室，江苏徐州 221000)

糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或者相对不足而导致的一系列临床综合征。随着人们生活方式改变、人口老龄化问题日益加剧，糖尿病患者人数迅速增加。在我国，高达62.37%的2型糖尿病患者会出现不同程度的晶状体混浊即糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)，且发病率随病程的延长而明显增加。DC的发病机制比较复杂，涉及多种因素，其中醛糖还原酶(aldose reductase，AR)的激活和表达上调，糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的大量积聚以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱发的氧化应激损伤等被认为是DC发病的关键环节［1-4］。

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是采用现代提取技术从银杏叶中提取的活性成分，其有效成分主要包括黄酮苷类和萜类［5］。本课题组前期研究发现，GBE可以通过其抗氧化作用及抑制AGEs、AR的作用，抑制高糖诱发的人晶状体上皮细胞的凋亡，这对于延缓糖尿病性白内障的发生具有极其重要的意义［6］。为进一步验证GBE对DC的疗效，并探索其防治DC的机制，我们在链脲霉素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病性白内障大鼠上观察了GBE对其晶状体混浊度、抗氧化指标、糖基化终产物含量和醛糖还原酶表达的影响，以抗白内障药物苄达赖氨酸(bendazac lysine，BDL)作为阳性对照药，通过上述实验明确GBE对DC的防治作用，并初步探讨其作用机制，以期能为DC的防治寻找新的药物，为增加GBE的临床适应症提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康♂SD大鼠，体质量150～190 g，经散瞳后检查晶状体无异常，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK 2002-0038。

1.2 主要试剂 STZ，美国Calbiochem公司;GBE (含银杏黄酮＞24%，萜类＞6%)，邳州富伟生化有限公司;苄达赖氨酸，浙江平湖莎普爱恩制药有限公司;大鼠AGEs酶联免疫试剂盒，美国R＆D公司;羊抗AR多克隆抗体，美国Santa Cruz公司;兔抗β-Tubulin抗体美国Bioworld公司;T-SOD试剂盒、CAT可见光试剂盒、GSH试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及模型制备 SD大鼠随机分为正常对照(NS)组(8只)和糖尿病造模组(50只)。禁食24 h后，腹腔一次性注射STZ 65 mg·kg-1，NS注射等量柠檬酸钠缓冲液(pH=4.4)。72 h后尾静脉取血，测定空腹血糖≥13.88 mmol·L-1者为造模成功。将造模成功的SD大鼠随机分为5组:DC模型组(DC)、GBE低剂量治疗组(GL)、GBE中剂量治疗组(GM)、GBE高剂量治疗组(GH)、苄达赖氨酸(BDL)对照组，各组8只。各组成模当日作为实验d 1，低中高GBE治疗组剂量分别为50、100、200 mg·kg-1，BDL组的剂量为200 mg·kg-1，均以1 %羧甲基纤维素配成不同浓度的混悬液灌胃给药，每天1次，NS组、DC模型组均给予同体积的1%羧甲基纤维素。所有动物在整个实验期间均喂标准饮食，自由饮水，不应用其它药物。

1.3.2 样本收集 给药12周后，测定各组大鼠血糖水平，称重麻醉后迅速摘除双眼眼球，显微镜下分离晶状体，仔细剔除晶状体上附着的虹膜及悬韧带，称重标记，-80℃冰箱保存待用。

1.3.3 晶状体混浊度的分级 1%托品酰胺滴眼液点大鼠双眼1次，5min后使用裂隙灯观察晶状体变化，观察和记录大鼠晶状体形态的改变，并将晶体混浊程度参照Azuma等［7］的标准分为5级:Ⅰ级:无混浊，晶体透明;Ⅱ级:轻度混浊，晶体周边出现空泡;Ⅲ级:中度混浊，晶体周边空泡向中心扩展，核出现雾状混浊;Ⅳ级:高度混浊，晶体周边空泡扩展到核区，核雾状混浊加重;Ⅴ级:核混浊，白内障成熟。

1.3.4 抗氧化指标的测定 每组各取6个晶状体制备晶状体匀浆液。将低温保存的晶状体标本吸干水分后，按重量体积比加入预冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆，4 000 r·min-1，低温离心 10 min，取上清，分装待测。参照试剂盒说明测定CAT、GSH、T-SOD水平。

1.3.5 糖基化终末产物(AGEs)含量测定 取大鼠晶状体匀浆液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs)的水平，具体操作参照试剂盒说明。

1.3.6 免疫印迹测定醛糖还原酶(AR)相对表达量采用BCA法测定样品蛋白浓度。将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加样缓冲液后按50 μg/孔上样，经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以半干转法转移至硝酸纤维素膜上。室温封闭3 h后加入按1∶200浓度稀释的羊抗AR多克隆抗体，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗(驴抗山羊Ig-AP)，室温孵育2 h。洗膜3次，以硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)显色，水洗终止反应。β-tubulin以相同方法检测。结果以Image J图像软件分析处理，测定条带灰度值，蛋白表达的变化以实验组中相应条带的灰度值相对于β-tubulin的倍数表示。

1.3.7 统计学处理 各组数据用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间比较采用q检验。等级资料用非参数秩和检验进行分析。

2 结果

2.1 对大鼠生理情况的影响 正常组大鼠活动频繁、毛发光泽、饮水量正常、尿量正常。DC组大鼠活动度低、眼球苍白、毛发枯黄无色泽、竖毛弓背、饮水量高、尿量多。GBE中、高剂量治疗组大鼠“三多一少”症状有所缓解，而饮水量和尿量仍然较高，垫料较潮。GBE低中高剂量组大鼠空腹血糖有一定程度的降低，但仍处于高血糖水平，与DC组比较差异无统计学意义(Tab 1)。

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group

Group 0 wk 12 wk NS 5.98±0.72 5.77±1.02 DC 26.34±3.15## 27.91±3.40## GL 25.66±2.71 25.07±2.87 GM 27.37±2.09 25.31±2.18 GH 26.31±2.43 24.10±2.33 BDL 25.15±3.06 24.01±2.97

2.2 GBE对晶状体混浊度的影响 经裂隙灯显微镜检查，正常对照组大鼠晶状体透明，无混浊发生。DC组大鼠晶状体混浊度明显高于正常对照组，出现雾状混浊、核混浊，多为Ⅲ～Ⅴ级。GBE中、高剂量组与DC组相比，大鼠晶状体混浊度有所减轻，其混浊度等级差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，提示GBE可降低DC大鼠晶状体混浊度，对DC大鼠晶状体出现混浊具有一定的抑制作用。BDL组晶状体混浊度等级与DC组相比无统计学意义(Tab 2)。

Tab 2 Effects of GBE on grading of lens opacification of rats(n=12)

Fig 1 Effect of GBE on cataractogenesis of rats

2.3 GBE对氧化应激的影响 与正常组相比，DC组大鼠晶状体组织中T-SOD活性，CAT活性和GSH含量明显降低(P＜0.01)，表明其抗氧化能力下降。与DC组相比，GBE高剂量治疗组的T-SOD活性，CAT活性和GSH含量升高(P＜0.01)，GBE中剂量组的各项指标也有升高(P＜0.05)。BDL组T-SOD活性升高(P＜0.05)，GSH含量与CAT酶活力水平无明显变化(Tab 3)，此结果表明GBE能明显改善DC大鼠晶状体的氧化应激状态，且在抗氧化作用方面较BDL更强。

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DC group

Group T-SOD/ U·mg-1Pro GSH/ mg· g-1Pro CAT/ U·mg-1Pro NS 23.95±1.89 4.79±0.69 4.07±0.26 DC 9.10±1.58## 1.67±0.44## 2.44±0.30## GL 11.28±2.05 2.05±0.22 2.68±0.33 GM 12.76±1.63* 2.54±0.50＊＊ 2.82±0.37 GH 16.97±2.88＊＊ 2.82±0.37＊＊ 2.98±0.31＊＊BDL 12.72±3.11*2.20±0.70 2.62±0.38

2.4 GBE对AGEs含量的影响 与正常组相比，DC组大鼠晶状体组织中的AGEs相对含量明显升高(P＜0.01)。与DC组相比，GBE高剂量治疗组的AGEs明显下降(P＜0.05)。BDL组大鼠晶状体组织中AGEs含量无明显降低(Tab 4)，提示GBE能够抑制DC大鼠晶状体AGEs的生成。

2.5 GBE对AR表达水平的影响 DC组大鼠晶状体组织中AR的相对表达量与正常组相比明显增多，差异有统计学意义(P＜0.01)。GBE高剂量治疗组的AR表达水平与DC组相比皆有明显降低(P＜0.01)。BDL治疗组的AR表达水平与DC对照组相比差异也有显著性(P＜0.01)。

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

#P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05 vs DC group

Group AGEs/ng·g-1Pro NS 8.77±1.02 DC 16.91±2.40# GL 15.07±2.77 GM 14.31±2.08 GH 13.70±2.33* BDL 15.01±3.06

Fig 2 Effect of GBE on the expression of AR of lens in diabetic rats(±s，n=6)

3 讨论

白内障(cataract)即晶状体混浊，老化、遗传、代谢异常等因素可引起晶状体代谢紊乱，导致蛋白质变性而出现混浊，发生白内障，糖尿病是其重要的危险因素之一［8］。大量研究表明，糖尿病患者白内障的发生率明显高于非糖尿病患者，且晶状体混浊的发生速度更快，表明高糖在DC形成过程中是始动因素，且是晶状体混浊的主要诱发因素。长期的实验室研究和临床观察对DC的发病机制提出了多种不同的学说，其中较为成熟的学说主要有3种，即多元醇代谢异常学说、非酶糖基化学说和氧化应激学说［9］。近期研究更倾向认为DC是多种机制综合作用的结果，这几种机制相互关联，都参与了白内障的形成。

氧化应激在DC的病理进程中扮演着非常重要的角色。大量证据表明，在高糖环境下，葡萄糖自身氧化作用、葡萄糖非酶糖基化形成晚期糖基化终末产物的过程中、高糖激活的多元醇途径以及PKC的活化均产生大量ROS，从而消耗大量还原性谷胱甘肽，严重削弱机体的抗氧化防御系统，使其处于氧化应激状态［10-11］。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和过氧化氢酶均是晶状体内抗氧化的关键物质，我们对晶状体中这3种酶进行测定后，发现在糖尿病大鼠晶状体组织中它们的活性或含量均明显下降。这样的变化必然会导致晶状体更易受到氧化剂的攻击，致使晶状体蛋白质发生氧化损伤，最终发生晶状体混浊。在本实验中，GBE能够明显提高DC大鼠晶状体内CAT、T-SOD的酶活性及GSH的含量，帮助维持晶状体内正常的氧化还原状态，且与对照药BDL相比，GBE的抗氧化作用更强也更广泛。这可能是由于GBE能够有效地阻止氧自由基进入晶状体组织，抵抗氧自由基对蛋白质、膜磷脂和核酸造成的氧化损伤，同时消除氧自由基反应生成的其他有害物质。

AGEs是由蛋白质、脂质及DNA等与还原糖之间形成的非酶促糖基化终末产物，其形成是一个不可逆的化学过程，一经形成即不断累积于组织中，影响组织的结构和功能。AGEs的形成被认为是糖基化过程中的中介体，存在于包括糖尿病性白内障在内的多种糖尿病并发症中。研究发现糖尿病患者白内障的房水中AGEs产物大量堆积，证实了AGEs与糖尿病患者白内障的发病密切相关［12］。此外，AGEs的产生与氧化应激也有着密切的联系。氧化应激状态的持续存在可促进AGEs的不断生成，同时AGEs与其受体的结合又可刺激ROS的产生，氧化应激和AGEs相互作用、互相上调，共同加速DC的形成［13］。本实验中，DC组大鼠晶状体中的AGEs相对含量与正常对照组相比明显升高;高剂量的GBE能使AGEs水平下降，说明GBE能够有效降低DC大鼠晶状体中AGEs的生成和积聚，这对DC的防治颇具意义。而BDL治疗组大鼠的晶状体AGEs含量未有明显降低。

多元醇代谢通路是葡萄糖代谢通路之一，与DC的病理进程有着极其密切的关系，AR是该通路的限速酶也是氧化还原通路的最后的共同步骤。已有研究发现，AR在晶状体是高糖诱发氧化应激的关键酶。在晶状体过度表达AR的小鼠上，其DC的形成可大大提前［14］。多元醇通路的激活还会引起NADPH的大量消耗和NADH聚集，导致来源于二羟基丙酮磷酸盐的二酰甘油明显增加，激活蛋白激酶C，生成氧自由基，造成氧化应激，加速糖尿病性白内障的发生发展［15］。本实验中，DC大鼠的AR表达明显增多，表明高糖能使AR表达上调。高剂量GBE即可明显抑制其表达，因此GBE可以改善因AR表达增多所诱发的一系列与DC相关的症状; BDL由于是AR抑制剂，其抑制AR表达的效果更为明显。

综合以上的实验结果可见，GBE可减轻大鼠糖尿病性白内障引起的晶状体混浊，这种作用可能与GBE抑制AGEs产生、AR表达以及蛋白质氧化损伤有关，展现出GBE作为天然药物多靶点治疗的优势，同时也为多元醇代谢异常学说、非酶糖基化学说和氧化应激学说提供了实验依据。

［1］ Wong T Y，Loon S C，Saw S M，et al.The epidemiology of age related eye diseases in Asia［J］.Br J Ophthalmol，2006，90(4):506 -11.

［2］ Obrosova I G，Chung S S，Kador P F.Diabetic cataracts:mechanisms and management［J］.Diabetes Metab Res Rev，2010，26 (3):172-80.

［3］ Suzen S，Buyukbingol E.Recent studies of aldose reductase enzyme inhibition for diabetic complications［J］.Curr Med Chem，2003，10(15):1329-52.

［4］ 冀立霞，申竹芳.糖性白内障渗透性膨胀期相关机制的研究进展［J］.中国药理学通报，2009，25(4):421-4.

［4］ Ji J X，Sheng Z F.The genes related with the osmotic expansion in sugar cataract［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):421-4.

［5］ 侯 晞，梁 枫，李爱剑，等.银杏叶提取物联合依达拉奉对气虚血瘀型脑缺血/再灌注大鼠血液学的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(8):1049-53.

［5］ Hou X，Liang F，Li A J，et al.Effects of EGb combined with ED on hematdogy in cerebral ischemia reperfusion injury in rats with Qi deficiency and blood stasis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26 (8):1049-53.

［6］ Wu Z M，Yin X X，Ji L，et al.Ginkgo biloba extract prevents against apoptosis induced by high glucose in human lens epithelial cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29(9):1042-50.

［7］ Azuma M，Shearer T R，Matsumoto T，et al.CalpainⅡ in two in vivo models of sugar cataract［J］.Exp Eye Res，1990，54(4):393 -401.

［8］ Prahs P，Helbig H.Diabetic eye disease［J］.Ther Umsch，2009，66(3):183-8.

［9］ Obrosova I G，Chung S S，Kador P F.Diabetic cataracts:mechanisms and management［J］.Diabetes Metab Res Rev，2010，26 (3):172-80.

［10］Kocic R，Ciric V.New aspects about the impact of oxidative stress on development of chronic diabetic complications［J］.Med Pregl，2009，62(Suppl 3):70-4.

［11］Simsek M，Naziroglu M，Erdinç A.Moderate exercise with a dietary vitamin C and e combination protects against streptozotocin-in-duced oxidative damage to the kidney and lens in pregnant rats［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2005，113(1):53-9.

［12］罗 怡，吴继红，张圣海，等.糖尿病患者白内障房水晚期糖基化终末产物及转化生长因子的变化［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2008，8(6):368-70.

［12］Luo Y，Wu J H，Zhang S H，et al.Alteration of the levels of advanced glycation end products and transforming growth factor beta and glucose in the aqueous humor of diabetic cataract patients［J］.Chin J Ophth Otorhinol，2008，8(6):368-70.

［13］Bras I D，Colitz C M，Kusewitt D F，et al.Evaluation of advanced glycation end-products in diabetic and inherited canine cataracts［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2007，245(2):249-57.

［14］Biswas S，Harris F，Singh J，Phoenix D.Role of calpains in diabetes mellitus-induced cataractogenesis:a mini review［J］.Mol Cell Biochem，2004，261(1-2):151-9.

［15］Kubo E，Urakami T，Fatma N，et al.Polyol pathway-dependent osmotic and oxidative stresses in aldosereductase-mediated apoptos is in human lens epithelial cells:role of AOP2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，314(4):1050-6.