小白菊内酯诱导耐药白血病细胞K562/ADR凋亡的研究

石倩倩，丁亚辉，祁瑞哲，高瀛岱，杨 铭，纪 庆，罗 成

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457;2.南开大学药学院，天津 300071; 3.实验血液学国家重点实验室，中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)，天津 300020)

白血病是严重威胁人类生命和健康的恶性疾病，据统计，白血病在我国的发病率为3－4/10万人。目前治疗白血病的主要手段有化疗、放疗、骨髓移植等。在白血病的治疗方法中，化疗是常用和重要的治疗手段，但常规化疗药易出现耐药又有毒副作用，新设计开发的靶向药物伊马替尼(格列卫)也没有明显提高白血病的治愈率，耐药性的发生依然是困扰临床治疗的一大难题。多药耐药(multidrugresistance，MDR)是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性，对其他化学结构及机制不同的化疗药物也产生交叉耐药性。MDR是导致化疗失败最重要的原因之一，也是肿瘤治疗中亟待解决的问题。小白菊内酯(PTL)是来源于菊科植物的倍半萜内酯，一直用于治疗偏头疼和风湿性关节炎。近来学者研究发现，小白菊内酯具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的活性，可诱导结肠癌、肝癌、多发性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞凋亡，并对其他抗癌药物具有增敏效应［1－3］。

白血病细胞K562/ADR是一种对一线化疗药多柔比星、长春新碱、伊马替尼等耐药的细胞系，本研究拟利用此细胞系研究小白菊内酯对耐药白血病细胞是否能有较强的杀伤作用，以及是否能诱导耐药细胞的凋亡。为解决白血病耐药问题寻找可能的解决办法，为小白菊内酯应用于耐药白血病的治疗提供一定的理论基础。

1 材料

RPMI 1640培养基购自Gibco公司;K562和阿霉素长期诱导的耐药细胞株K562/ADR由中国医学科学院血液学研究所实验室提供;MTT购自Sigma公司;RIPA细胞裂解液、Beyo ECL Plus显色试剂、ROS检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司;细胞凋亡试剂盒购自BD公司;LDH释放试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司;小白菊内酯化合物由南开大学陈悦教授实验室提供，纯度为99.9%，溶于DMSO。

2 方法

2.1 MTT检测药物的抑制活性 取对数生长期的K562和K562/ADR细胞，用含有10%血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×109·L－1，接种于96孔板中，每孔180 μl。在37℃，5%CO2条件下培养1 h后，加入配制好的相应浓度的药20 μl，每个浓度设6个复孔，处理组加入不同浓度的药，对照组加入相应体积的生理盐水。培养72 h后加入5 g· L－1的MTT 20 μl。37℃继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡混匀后在酶标仪上检测570 nm处光密度(OD)值。用软件GraphPad Prism 5.01计算IC50值。

2.2 LDH释放实验检测药物的细胞毒作用 取处于对数生长期的K562和K562/ADR细胞，以不同浓度PTL处理24 h后加入96孔细胞培养板，5× 104细胞/孔，同时按步骤要求设置空对照孔(无细胞的培养液)、样品对照孔(未处理的对照细胞)、样品最大酶活性对照孔(未处理的后续裂解的细胞)，加入裂解液和补充液后，在5%CO2条件下继续孵育培养1 h，离心后吸取上清，按照操作步骤先后加入反应底物和终止液。酶标仪测定D492值后，按下式计算杀伤百分率:处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数×100%

2.3 细胞凋亡分析检测药物对细胞凋亡的作用取处于对数生长期的K562和K562/ADR细胞，以每孔1×108·L－1细胞悬液铺入6孔板中，每孔2 ml。1 h后用不同浓度的药物处理细胞。24 h后将6孔板中的细胞吸入流式管中。1 500 r·min－1离心7 min，弃上清，用1×Binding buffer将沉淀重悬，分别加入5 μl的Annexin-ⅤFITC和PI，室温避光孵育15 min，加入300 μl的1×Binding buffer。FITC和PI的激发波长分别为488 nm、488 nm，1 h内进行流式检测(流式细胞仪为BD LSRII数字化分析型流式细胞仪)。凋亡率包括早期和晚期凋亡率。

2.4 ROS水平检测 取对数生长期的细胞，加入10 μmol·L－1PTL作用1 h，取5×105个细胞，加入流式管中，离心后弃上清。预冷的PBS洗1遍，用稀释的10 μmol·L－1DCF-DA探针37℃孵育30 min。离心弃上清，用300 μl PBS重悬，激发波长为488 nm，上机检测。为了检测ROS在细胞凋亡中的作用。用5 mmol·L－1NAC预处理细胞1 h，与10 μmol·L－1PTL共同处理1 h后，步骤同上，检测ROS的变化;与10 μmol·L－1PTL共同处理24 h后，同“2.3”中的步骤，检测凋亡率的变化。

2.5 Western blot法检测蛋白表达的变化 药物处理后收集细胞，PBS洗1遍，用RIPA裂解液置冰上裂解30 min，超声波裂解提取蛋白。4℃，12 000 r ·min－1离心10 min。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。12%的SDS-PAGE电泳分离上样蛋白，湿转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶4℃封闭非特异性抗原过夜，孵育一抗、二抗。ECL化学发光法与暗室显影。

3 结果

3.1 PTL对K562/ADR的增殖抑制作用 不同浓度(1.25、2.5、5、10、15、20、50 μmol·L－1)的PTL处理细胞72 h后，PTL对K562/ADR有明显的抑制细胞增殖的作用，并呈剂量依赖性。PTL对K562/ ADR细胞的IC50值为:(4.36±0.37)μmol·L－1。PTL对K562细胞的IC50值为:(3.62±0.79)μmol ·L－1，经t检验，P＞0.05，两者差异无显著性。如Fig 1所示。

Fig 1 MTT assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.2 PTL对K562/ADR的细胞毒作用 PTL对K562/ADR有明显的细胞毒作用，并呈剂量依赖性。PTL对K562/ADR细胞的LC50值为:(10.6±2.81) μmol·L－1。PTL对K562细胞的LC50值为:(9.04 ±2.63)μmol·L－1，经t检验，P＞0.05，两者差异无显著性。如Fig 2所示。

Fig 2 LDH assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.3 PTL诱导细胞凋亡率的测定 利用Annexin V-PI双染法测定经10 μmol·L－1PTL处理细胞24 h后的细胞凋亡率。如Fig 2所示，10 μmol·L－1PTL能诱导K562/ADR细胞凋亡，凋亡率为(31.21 ±0.40)%，K562细胞的凋亡率为(29.15± 3.45)%，两者的凋亡率差异无显著性(P＞0.05)。结果说明，PTL能够诱导耐药细胞的凋亡，从而发挥抗肿瘤活性。

Fig 3 10 μmol·L－1PTL induced apoptosis of K562，K562/ADR for 24 h

3.4 PTL对K562/ADR细胞内ROS的影响 为了探讨PTL诱导细胞凋亡是否与升高细胞内的ROS相关，并激活下游的凋亡通路。用10 μmol· L－1PTL处理细胞1 h，测定细胞内ROS的水平。结果显示，10 μmol·L－1PTL处理细胞1 h，与对照相比，吸收峰明显右移，如Fig 4所示。说明K562/ ADR细胞内ROS水平升高，与K562细胞相比差异无显著性。为了验证ROS在PTL诱导细胞凋亡过程的作用，以N-乙酰半胱氨酸(NAC)为ROS的清除剂。NAC预处理1 h，PTL与NAC共同处理细胞1 h后，细胞内ROS被抑制;PTL与NAC共同处理细胞24 h后，细胞 K562/ADR的凋亡率下降为(9.16±0.98)%，K562细胞的凋亡率为(5.24± 0.64)%。PTL单独处理与PTL与NAC共同处理细胞凋亡率差异有显著性(P＜0.05)。如Fig 5所示。

Fig 4 Increase of ROS in cells induced by PTL

Fig 5 Change of ROS level and apoptosis rate in K562，K562/ADR induced by PTL with NAC pretreatment

3.5 PTL诱导K562/ADR细胞内caspase-3、9蛋白的活化以及下调Bcl-2蛋白的表达 为了研究细胞凋亡的机制，我们检测了 caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax几种关键的凋亡相关蛋白。结果显示，10 μmol·L－1PTL处理细胞24 h，K562/ADR、K562细胞内蛋白Bcl-2表达下调，Bcl-2和Bax比值降低，caspase-3、caspase-9酶源被激活，caspase-3出现降解片段。NAC预处理后，其蛋白表达恢复。如Fig 6所示。结果说明，PTL诱导的细胞凋亡在Bcl-2家族蛋白的参与下，由线粒体途径介导信号传导。

Fig 6 Expression of proteins Bcl-2，caspase-3，caspase-9 induced by PTL and PTL+NAC

4 讨论

目前认为造成白血病发生、治疗中耐药和复发的根本原因是患者体内存在着一群白血病干细胞(leukemia stem cell，LSC)。2005年，Jordan等发现PTL能特异性靶向作用于白血病干细胞，而且对正常造血干细胞影响较小［4］。目前推测PTL特异性靶向LSC的机制是:核转录因子NF-κB在LSC中处于活化而在正常干细胞(HSC)中是非活化的，而PTL可以抑制 NF-κB的激活这一细胞生存途径［5，13］。

我们的结果显示，PTL能抑制耐药白血病细胞K562/ADR的细胞增殖。10 μmol·L－1PTL处理细胞24 h能明显诱导耐药细胞的凋亡，而且与K562细胞相比差异无显著性。K562/ADR、K562对常用一线化疗药多柔比星、长春新碱、格列卫的耐药倍数分别为约100倍、约100倍 、约10倍，而PTL对K562/ADR、K562两种细胞的杀伤、凋亡差异无显著性。这说明PTL对耐药白血病细胞的杀伤作用机制与其不同。

在通常情况下，急性、高浓度的ROS损伤DNA、蛋白质及脂质，引起细胞凋亡、坏死［6－9］。当胞内的ROS水平较高时，细胞色素C(CytC)从线粒体被释放到胞质中，下调Bcl-2有助于CytC的释放。胞质中的CytC与凋亡激活因子(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小体，pro-caspase-9自身激活，形成有活性的caspase-9，后者进一步激活caspase-3、6、7等，进而导致细胞凋亡［10－12］。Western blot结果显示，PTL均能够下调Bcl-2，pro-caspase-9、pro-caspase-3蛋白的表达进而诱导细胞凋亡。用NAC预处理后，能恢复它们的表达。这说明PTL对凋亡的诱导作用与ROS的参与相关。

综上，PTL对耐药白血病细胞具有较好的抑制活性，并诱导其凋亡，可能的机制是其刺激细胞内的ROS升高，下调Bcl-2蛋白表达，进而激活线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。PTL有可能成为治疗临床耐药白血病的潜在药物。

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