重组人角质细胞生长因子-2对实验秃毛大鼠的毛发再生作用

王 泽，黄鹏煌，赵海洋，李海燕，田海山，4，李校堃1，，4

(1.吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林长春 130021;2.温州医学院药学院，浙江温州 325035; 3.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130021;4.浙江格鲁斯特生物科技有限公司，浙江温州 325000)

角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)由成纤维细胞和其它间充质来源的细胞分泌，能与表达于上皮细胞的激酶受体FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb相结合，通过间质-上皮细胞相互作用的旁分泌方式发挥作用，特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移［1－2］。KGF-2与受体FGFR2Ⅲb的亲和力很高，是其特异性配体。KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的C端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用。其专一靶细胞是表皮细胞，能刺激所有皮肤内的表皮基本单位包括毛囊、皮脂腺、汗腺生长［3，4］。

表皮毛囊生长受间质和上皮细胞相互作用的调节，使其经历生长期、退化期和终期的循环［5］。在循环中最主要的动力是毛囊的间充质，尤其是真皮乳突细胞。上皮干细胞，存在于毛囊的凸起部位，可以对来自真皮乳突细胞的感应信号产生反应［6］，对感应信号的反应可以刺激干细胞在毛囊凸起部位的增殖，然后子代干细胞向下生长至真皮深处，于此同时毛母质细胞开始生长并且复杂的毛囊结构开始形成。

KGF-2在真皮乳突细胞中被发现，并且它的受体FGFR2Ⅲb在角蛋白细胞毗邻的外根鞘中被发现［7］。KGF-2是毛囊细胞间质衍生的刺激物。10 μg·L－1的KGF-2就可以刺激培养的人毛囊细胞明显的生长［8］。因此，KGF-2有望成为刺激人毛发生长的治疗剂。但目前对KGF-2在促进毛发生长方面的研究只限于细胞水平，本实验着重在动物水平上证明KGF2能够刺激毛发再生。

目前的治疗药物主要为化药、中药、保健品、洗发、护发素类，尚未有基因工程药物应用于临床。在本项研究中，KGF-2在治疗人的脱发疾病上有望成为促进毛发生长的药剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及药品 重组人角质细胞生长因子-2冻干粉(浙江省生物制药重点实验室制备);SD大鼠，体质量200 g左右，♂，60只，清洁级(温州医学院实验动物中心);重组人酸性成纤维细胞生长因子(浙江省生物制药重点实验室制备);5%米诺地尔酊(商品名:蔓迪，浙江万马药业)。

1.1.2 主要试剂及仪器 小动物活体成像仪(美国CRi公司);0.9%氯化钠注射液(浙江康乐药业);怡美宁异氟烷(山东科源制药有限公司);小动物专用吸入麻醉机(北京吉安得尔科技有限公司);薇婷脱毛膏(印度利洁时公司);光学显微镜(日本Nikon公司);石蜡包埋机(美国Thermo公司);石蜡切片机(美国Thermo公司);电子分析天平(瑞士MettlerToledo 公 司);CO2培 养 箱 (Thermo CELLBB15);二甲基亚砜DMSO(Gibco)

1.2 方法

1.2.1 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定rh-KGF2活性 收集培养至对数期的NIH3T3细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl，接种于96孔细胞培养板中，使待测细胞密度为5 000～10 000个/孔。37℃、5%CO2培养箱中孵育至细胞贴壁，大约24 h。倒掉原培养液，换饥饿培养基(低糖DMEM+ 0.5%FBS)，每孔100 μl，饥饿培养18 h。加入100 mg·L－1的rhKGF2样品溶液，每孔100 μl，设3个复孔，进行2倍梯度稀释，共7个稀释度。另选3个复孔加饥饿培养基做阴性对照，每孔100 μl。37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h。每孔加入25 μl MTT溶液(5 g·L－1)，继续培养4 h。倒掉液体，每孔加150 μl二甲基亚砜，混匀后，放入酶标仪OD 570 nm (630 nm校准)测量各孔的吸光值，记录测定结果。

1.2.2 实验动物模型建立 参考文献报道方法［9］建立动物模型，大鼠经异氟烷吸入麻醉后，在其背部制作(4×3)cm2的脱毛区，先用宠物推剪将实验区毛发推短至3～5 mm，再涂抹脱毛膏，作用3 min后用刮匙轻轻(以免损伤皮肤)刮去毛发，再用纯净水清洗实验区，除去残余的脱毛膏。

1.2.3 实验动物分组 造模次日，选取造模成功的大鼠，利用SPSS 18.0统计软件根据初始体重进行随机分组，即正常对照组、5%米诺地尔组(50 g· L－1)、aFGF组(4 mg·L－1)、rhKGF2高(100 mg· L－1)、中(50 mg·L－1)、低(10 mg·L－1)剂量组、0.9%生理盐水组。每组大鼠8只。

1.2.4 实验动物给药 每日给药1次(正常对照组除外)，连续给药14 d。每次给药前先用75%酒精进行实验区常规消毒，再用0.5 mm的滚针在实验区来回滚3次(5%米诺地尔组除外)，最后用无菌棉棒进行实验区皮肤涂抹给药。5%米诺地尔组每次涂抹1 ml，aFGF组、rhKGF2高、中、低剂量组、0.9%生理盐水组每次涂抹300 μl。

1.2.5 实验动物体重记录 以给药第1、5、9、14天为主要观察、记录时间点，称量各组大鼠的体重并记录。

1.2.6 实验动物脱毛区毛长记录 以给药第1、5、9、14天为主要观察，记录时间点，拔取脱毛区最长毛8根，放大镜下用游标卡尺测定长度，并计算平均值，作为各大鼠脱毛区新生毛的长度，再计算每组大鼠毛发均值。

1.2.7 实验动物脱毛区毛发生长状况观察 以给药第1、5、9、14天为主要观察、记录时间点，对大鼠背部脱毛区进行照相机拍照记录(正常对照组除外)。

1.2.8 实验动物脱毛区毛重记录 于给药第14天刮取大鼠脱毛区全部体毛，用万分之一电子分析天平称重，作为各大鼠脱毛区新生毛的重量，再计算每组大鼠毛重均值(正常对照组除外)。

1.2.9 实验动物脱毛区皮肤组织病理学检查 于给药第14天处死大鼠，切取各组(正常对照组除外)大鼠背部脱毛区相同位置皮肤组织块，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚约7 μm，HE染色，光学显微镜下观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件对所得数据进行统计学处理，所有数据均以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验。

2 结果

2.1 rhKGF2活性测定结果 rhKGF2处理NIH3T3细胞48 h后，在1～100 mg·L－1之间rh-KGF2对NIH3T3细胞有明显的促进增殖作用，呈现出良好的蛋白活性，且呈现剂量－效应关系。结果见Fig 1。

2.2 实验动物模型建立成功 造模次日，观察大鼠背部脱毛区皮肤，表面光滑，无过敏、红肿、损伤现象出现，提示造模成功。

2.3 给药第1、5、9、14天实验动物体重变化 实验结果显示，与正常对照组相比，各组体重均呈现正常增长趋势，差异无显著性(P＞0.05)。说明各组受试药品对实验大鼠的正常生长无影响。结果见Fig 2。

2.4 给药第1、5、9、14天实验动物脱毛区毛发生长长度变化 实验结果显示，给药前各组大鼠背部脱毛区毛发均被全部去除(正常对照组除外)。在给药第5、9、14天，与正常对照组相比，0.9%生理盐水组毛发长度变短，差异有显著性(P＜0.01);在给药第5、9天，与0.9%生理盐水组相比，rhKGF2高、中剂量组差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，rhKGF2低剂量组无显著性差异(P＞0.05)，5%米诺地尔组、aFGF组存在显著性差异(P＜0.01);在给药第14天，与0.9%生理盐水组相比，rhKGF2高、中、低剂量组差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，5%米诺地尔组、aFGF组差异有显著性(P＜0.01，P＜0.01)。结果见Fig 3。

Fig 1 rhKGF2 stimulated NIH3T3 cell proliferation assay

Fig 2 Body weight of the experimental SD rats(±s，n=8)

2.5 给药第14天实验动物脱毛区毛发重量变化实验结果显示，在给药第14天，与0.9%生理盐水组比较，5%米诺地尔组、aFGF组、rhKGF2高、中、低剂量组均差异有显著性(P＜0.01)。结果见Fig 4。

2.6 给药第1、5、9、14天实验动物脱毛区毛发生长状况 实验结果显示，在给药第1天，各组大鼠脱毛区皮肤光滑、红润，无红肿、损伤现象出现，无残损毛发存在;在给药第5天，各组大鼠脱毛区毛发均呈现生长状态，5%米诺地尔组、rhKGF2中剂量组、aFGF组呈现较为明显，并且毛发生长密度均匀;在给药第9天，可见5%米诺地尔组、rhKGF2中剂量组、aFGF组明显变长，并且毛发生长密度变大。rhKGF2高剂量组也呈现明显的生长状态;在给药第14天，可见5%米诺地尔组、rhKGF2中剂量组、aFGF组已基本恢复到正常毛发长度水平，rhKGF2高、低剂量组和0.9%生理盐水组毛发生长状态明显，但毛发密度不均。需要注意的是，rhKGF2高、低剂量组之间并无明显差异，但中剂量组较高、低剂量组而言，效果明显。结果见Fig 5。

Fig 3 Hair length of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 4 Hair weight of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 5 Hair growth conditions of the experimental rats

2.7 给药第14天实验动物脱毛区皮肤组织病理学检查 组织病理切片结果显示，在100倍光镜下，给药第14天，5%米诺地尔组、aFGF组、rhKGF2中剂量组真皮及皮下组织中可见大量新生毛囊及新生的内毛根鞘，无毛囊萎缩变小现象，胶原纤维正常，无炎症细胞浸润，并且毛囊向下生长至皮下，趋于成熟。真皮厚度已由毛发快速生长期(变厚)恢复到正常水平。rhKGF2高、低剂量组真皮及皮下可见较多新生毛囊，并且在真皮及皮下的交界处有大量毛囊，说明毛囊处于新生到成熟的过渡状态，还未成熟，真皮厚度由毛发快速生长期(变厚)向正常水平恢复(未恢复到正常厚度)。0.9%生理盐水组真皮处可见大量新生毛囊，真皮厚度处于最厚阶段(毛发快速生长期)。结果见Fig 6。

Fig 6 Taking the experimental skin for histopathological examination(HE×100)

3 讨论

毛发疾病特别是斑秃，困扰着无数的患者，它所带来的心理压力远远大于疾病本身，虽有很多宣传治疗脱发的产品，但大多数均为卫消字、卫健字、卫妆字、卫食字等产品，其效果往往难以保证，甚至会对治疗者产生不良反应。美国开发了第一个治疗脱发疾病的外用化学药品－米诺地尔溶液，并获得了FDA的批准，成为目前唯一被批准治疗脱发的OTC药物。该药物经头皮吸收后可以扩张头皮下血管，改善毛囊周围的微循环［10］，减少毛囊周围的炎症细胞浸润，延缓上皮基质细胞的衰老，从而使萎缩的毛囊肥大并促进毛发的生长［11］。

近来研究发现，许多生物活性物质，如角质细胞生长因子-2(KGF-2)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等对毛发生长有明显的调节作用，已成为该领域研究的热点［12］。

本实验以5%米诺地尔溶液为阳性药物，比较rhKGF2对毛发生长的作用效果，但是米诺地尔为化学类药物，而rhKGF2为蛋白类药物，二者之间存在着本质的差别，所以在本实验中又设立了aFGF(4 mg·L－1)［13］阳性药物组，以便更充分的说明 rh-KGF2对毛发生长的作用效果。

与正常对照组比较，本研究中各组大鼠体重差异无显著性(P＞0.05)，均呈现正常生长趋势，一定程度上说明受试药品对动物的正常生长不存在明显影响。由实验结果可知，rhKGF2高、中、低剂量均对实验大鼠的毛发生长有作用，以中剂量最为明显。rhKGF2高剂量与低剂量二者之间比较，在毛发生长方面的作用效果近似相同，而中剂量与二者比较却效果显著，说明rhKGF2高剂量(100 mg·L－1)有可能是rhKGF2作用于毛发生长的退行期剂量，另外本实验从实验结果中推测中剂量(50 mg·L－1)到高剂量(100 mg·L－1)之间可能还存在比中剂量(50 mg·L－1)作用效果更好的剂量或平台期剂量，有待进一步实验确认。rhKGF2中剂量组在毛发生长长度和毛发重量方面与5%米诺地尔组和aFGF组相比，数据统计上虽差异无显著性，但由实验结果可见，rhKGF2在毛发再生的作用效果上与5%米诺地尔(阳性药物)相当，略强于aFGF(阳性药物)。病理切片结果显示，在促进毛囊新生与成熟方面，rhKGF2也表现较好的作用效果，并且不会引起皮肤病变。推测rhKGF2促进毛发生长的机制是由于刺激毛囊干细胞、毛母质细胞的增殖与分化，并在一定程度上刺激毛囊上皮细胞的增殖与分化，从而促进毛囊的新生与成熟。

本实验为基因工程蛋白类药物rhKGF2作为应用于临床治疗脱发的候选药物提供了有力依据。可以开发成为比化学类药物更为安全的新一代治疗秃发的产品。

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