天山雪莲UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

唐亚萍，原慧，覃建兵

新疆师范大学分子生物学与生物信息研究室，新疆 乌鲁木齐 830053

黄酮类化合物是植物次生代谢过程中主要的产物之一，在植物的生理和形态学方面发挥着各种各样的功能。黄酮类化合物能够帮助植物抗紫外线、抵抗病原微生物的侵害、抗虫害并在植物生殖过程中担当信使[1]。黄酮类化合物也是人类和动物的重要营养物质之一，尤其在人类的营养和医药方面，黄酮类化合物具有抗辐射、抗氧化、抗癌及心血管疾病等方面发挥着重要的作用。

糖基转移酶广泛存在于植物中，催化植物次生代谢产物的合成，是植物次生代谢过程中的重要部分，是天山雪莲药用化学成分花青素的生物合成的关键酶。UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶 (3GT) 催化UDP葡萄糖的糖基取代花色素的3-OH集团，催化不稳定的花色素糖苷形成各种稳定的花色苷[2]，对花色素进行糖基化修饰，以增加其稳定性和水溶性。Kho等[3]1978年首次对3GT基因的遗传调控和酶活性进行报道，3GT基因是1984年采用转座子标签技术从玉米中分离而来[4]，随后控制3GT基因活性的遗传位点An1、An2和An3也在矮牵牛中被分离出来[5]。

天山雪莲为新疆特有的珍惜名贵中药，为国家三级保护渐危植物[6]，特殊的生长环境造就了其独特的药用价值。黄酮类化合物是天山雪莲的主要药用成分，在水母雪莲Saussurea medusa、天山雪莲 Saussurea involucrate和雪兔子Saussurea gossypiphora野生植株中，天山雪莲总黄酮的抗氧化活性最高[7]。天山雪莲花青素属黄酮类化合物，具有抗氧化、抗辐射、抗癌等作用。由于人类对天山雪莲自然资源的掠夺性开采，使得该物种濒临灭绝，目前有关天山雪莲分子生物学的研究较少。本研究从天山雪莲中克隆了3GT基因，运用生物信息软件对3GT基因的蛋白质序列进行分析，构建了该蛋白的系统进化树，通过农杆菌介导的同源转化，经筛选得到转基因天山雪莲愈伤组织，其总黄酮含量明显高于非转基因的愈伤组织。初步鉴定了天山雪莲3GT基因在黄酮代谢途径中的作用，为提高天山雪莲中药用化学成分黄酮类物质及实现天山雪莲花青素的人工生物合成的研究奠定基础，为解决天山雪莲资源匮乏提供参考。

1 材料与方法

1.1 天山雪莲材料及实验试剂

野生天山雪莲种子采集于天山“一号冰川”，挑选籽粒饱满的种子50粒，经灭菌后接入1/2 MS培养基内[8]，待种子发芽长出真叶4~5片后使用。

大肠杆菌DH5α感受态、LA Taq酶、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、限制性内切酶 (TaKaRa公司)；TRIzol试剂、PCR 2.1 vector、PCR Super Mix、T4 DNA 连接酶 (Invitorgen公司)；RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司)；乙酰丁香酮(Sigma公司)；潮霉素 B (Roche Diagnostics GmbH，Germany)。

1.2 天山雪莲总RNA提取及cDNA第一链合成

采用液氮研磨法用 TRIzol试剂提取天山雪莲叶片、茎、根及愈伤组织总 RNA。按照RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第一链。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit及 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒说明书合成5′端及3′端完整的天山雪莲叶片cDNA第一链。

1.3 天山雪莲cDNA片段的同源克隆

根据3GT基因的同源序列利用Primer5.0及Oligo6.0设计基因特异引物FGT和RGT (表1)，以cDNA第一链为模板扩增天山雪莲3GT基因的保守区域，反应条件为：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增的PCR产物经Axygen的凝胶回收试剂盒回收目的条带后连接到PCR2.1载体中，经酶切鉴定送华大基因有限公司测序。

1.4 天山雪莲 3GT基因的 3′ RACE和5′ RACE

根据测序获得的cDNA片段，用生物信息软件设计基因特异引物 (表1)，以cDNA第一链为模板，3′ RACE outer Primer、3′ RACE inner Primer、GTF1和GTF2为引物，进行Nested PCR，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃~ 50℃30 s，72 ℃ 1 min ，30个循环 (每个循环降低0.5 ℃)；72 ℃延伸10 min。5′ RACE 以GTR1和GTR2为引物，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行PCR扩增，反应条件与3′ RACE反应条件相同。扩增产物经连接转化，PCR及酶切鉴定后测序。

表1 文中所用引物序列Table 1 Primer used in this study

1.5 cDNA全长扩增

依据 cDNA拼接序列，以基因特异引物FLGTF和 FLGTR，引物中划线部分为 BglⅡ和NheⅠ酶切位点，对cDNA序列进行全长扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，30个循环；72 ℃延伸10 min，并对扩增产物测序。

1.6 天山雪莲3GT基因cDNA序列及其编码蛋白氨基酸的序列分析

在 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和DNAMAN中进行基因序列的同源比较，在NCBI中的ORF Finding进行开放阅读框的预测，用软件DNAMEN对基因cDNA进行核苷酸序列分析，在网站Clustal W2 (www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行氨基酸序列的同源序列比对并构建系统进化树。

1.7 3GT基因的转录模式

用3GT基因的全长引物及用软件Primer5.0及Oligo6.0设计，对3GT基因组织器官表达模式进行分析。内参基因为β-actin基因特异引物。

1.8 3GT基因的表达载体的构建及农杆菌转化

将已获得的 3GT基因全长及表达载体pCAMBIA1305.1同时用内切酶BglⅡ和NheⅠ在恒温水浴锅中37 ℃双酶切2 h以上。酶切产物经回收纯化后连接转化入大肠杆菌Escherchia coli DH5α，提取大肠杆菌质粒，筛选阳性克隆，用电击转化法转化进入根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105中，用3GT全长基因特异引物进行 PCR检测转化的农杆菌菌株，将检测到的菌株命名为pS3GT。

1.9 3GT基因叶盘转化及转基因愈伤组织的筛选

天山雪莲叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小的叶盘，将该叶盘置于天山雪莲愈伤组织诱导培养基中暗培养 2 d，叶盘浸泡在含有pS3GT菌株及100 μmol/L乙酰丁香酮，OD600=0.5的MS液体培养基中10 min[9-10]。将共培养2 d的叶盘转入含有8 mg/L潮霉素 (Hygromycin，hyg) 的天山雪莲愈伤组织诱导培养基内进行转基因愈伤组织的筛选[11]，45 d后，提取在抗性培养基上生长的愈伤组织的 DNA，用潮霉素基因的特异引物hptF和hptR (表1) 进行转基因愈伤组织的筛选。

1.10 转基因愈伤组织的悬浮培养及紫外分光光度法测量总黄酮

将筛选到的转 3GT基因的愈伤组织及非转基因愈伤组织各0.2 g分别接入10 mL的N6液体培养基内进行悬浮培养[12]，光周期为12 h，转速110 r/min，培养温度为25 ℃。分别培养4、8、12、16 d，试验重复3次。将培养的愈伤组织在60 ℃烘箱内烘干，测量干重，并用80%乙醇，60 ℃浸泡过夜提取总黄酮，用紫外分光光度法测定[12]，波长为 510 nm，其芦丁标准品与其吸光度的直线方程：C=0.09344A−0.00230797，r=0.9992 (C为总黄酮含量单位是g/L，A为光的吸收变量)，并测量雪莲愈伤组织的总黄酮量。

2 结果与分析

2.1 天山雪莲 UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因cDNA片段的分析

根据双子叶植物3GT基因同源序列，运用生物信息软件设计的天山雪莲 3GT基因特异引物进行扩增，纯化此扩增产物并进行测序，结果获得1个327 bp的cDNA片段 (图1) 经生物信息软件DNAMAN、Clustal W2及Blast分析发现该片段与菊科向日葵属植物的葡萄糖苷转移酶基因UGT90A7 (GenBank Accession No. EU561019)高度同源，相似性达到100%，与鸢尾属植物的3GT (GenBank Accession No. AB161175) 基因相似性为88%，表明实验获得的cDNA片段为目的基因类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因片段。

2.2 天山雪莲 UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因全长cDNA的克隆与序列分析

依据天山雪莲中该基因cDNA片段的核苷酸序列设计特异引物，用RACE技术克隆目的基因的3′和5′cDNA末端序列进行，测序结果表明，其大小分别为570 bp和1 190 bp (图1)。

图1 3GT基因特异引物 RT-PCR、3′ RACE及5′ RACE扩增Fig. 1 PCR products of RT-PCR, 3′ RACE and 5′RACE. M : DNA marker; 1: product of primers FGT and RGT; 2: product of 3GT 3′ RACE; 3: product of 3GT 5′ RACE.

对已获得的3个cDNA片段进行序列拼接，结果获得了1个全长为1 721 bp的cDNA序列。在该 cDNA序列两端设计基因特异引物，进行PCR扩增、测序，得到1个大小为1 698 bp的cDNA片段，将此 1 698 bp片段与目的基因的cDNA拼接序列进行比对分析，分析结果显示两序列一致，这表明天山雪莲3GT基因cDNA拼接序列正确。天山雪莲3GT基因全长含有1 548 bp的开放阅读框，其 5′含有起始密码子ATG，3′端含有137 bp的非编码区，这表明天山雪莲3GT基因的cDNA序列完整，获得GenBank登录号 (Accession No. JN092127)。

2.3 天山雪莲3GT氨基酸序列分析

根据天山雪莲3GT基因cDNA全长序列推测其编码516个氨基酸残基。以来自不同物种的5种类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶氨基酸序列进行序列比对分析，推测天山雪莲类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶含有一个由 44个氨基酸残基构成的糖基转移酶的保守域PSPG[13]，如图2中划线部分，该保守序列被认为是结合糖基供体的区域。这表明，从天山雪莲中克隆得到的基因3GT具有类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因家族所具有的序列特征，进一步证明其为类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因。

2.4 天山雪莲3GT系统进化树分析

天山雪莲类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶与其他植物的 GT氨基酸序列的系统进化分析表明(图 3)，不同物种的类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶聚为一类，天山雪莲类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶与毛杨梅的3GT基因及草莓的GT6亲缘关系较近，Griesser等[14]运用原核表达，在体外获得草莓 GT6表达的蛋白，对该蛋白的分析表明，该蛋白参与类黄酮的糖基化。

图2 天山雪莲和其他物种3GT氨基酸序列比对分析Fig. 2 Muti-sequence alignment of UDP-glucosyltranserases proteinases from Saussurea involucrata and other organisms. Q40284: Manihot esculenta Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase; ABB92748: Fragaria x ananassa GT6; AAD21086: Forsythia x intermedia 3GT. The identical and positive amino acid resdues are denmed with “﹡” and “∶”.

2.5 天山雪莲3GT基因的转录模式分析

根据利用 3GT基因的保守引物扩增不同组织中的基因cDNA片段。从图4中可以看出，天山雪莲 3GT基因在叶和愈伤组织中的表达量比较高，在根中仅有少量的表达，在茎中几乎不表达。

2.6 天山雪莲3GT基因的表达载体构建及农杆菌转化

重组质粒构建 (图5)，挑取大肠杆菌中的单菌落用 BglⅡ和 NheⅠ双酶切重组质粒，得到预期大小1 808 bp的片段，并用3GT基因特异引物进行PCR检测得到预期1 808 bp的片段。经电击转化的农杆菌转化子的筛选与大肠杆菌重组子的筛选相同，均得到预期大小的片段。

图4 天山雪莲3GT基因在不同组织中的转录模式Fig. 4 Transcriptional pattern analysis of 3GT in different organs of S. involucrata. Transcripts were amplified using gene specific primers, with the PCR products separated using 1% agarose gel. Equal cycles for PCR reaction, different loadings for the different samples. L: leaf; C: callus; S: stem; R: root.

2.7 天山雪莲转3GT基因愈伤组织的筛选

经农杆菌侵染的雪莲叶片共150片，转入含有潮霉素的转基因愈伤组织筛选培养基内培养20 d后开始出愈，经45 d培养后，运用CTAB法提取雪莲愈伤组织的总 DNA。由于该遗传转化为同源转化，所以对转化子的筛选采用抗性标记基因的PCR检测，用潮霉素基因的特异引物进行转化子的筛选，共检测到 14个转化子(图6)，该基因的转化率为9.33%。

2.8 转天山雪莲 3GT基因的愈伤组织干重及总黄酮含量

图5 3GT表达载体的构建Fig. 5 Plasmid used in transformation of 3GT transgeneic. P35S: CaMV 35S promoter; T35S: CaMV 35S terminator; 3GT: S. involucrata UDP-glucose gene; hpt: hygromycin phosphotransferase gene.

图6 3GT基因转基因愈伤组织的检测Fig. 6 PCR analysis of transgenes in S. involucrata callus, hpt gene. 1: DNA marker; 2: positive control; 3: negative control; 4−11: S. involucrata callus PCR.

图7 悬浮培养雪莲愈伤组织干重及总黄酮含量Fig. 7 Dry weight and flavonoid content in S. involucrata callus after suspension culture. (A) The control of the S. involucrata callus. (B) 3GT gene transformated of S. involucrata callus.

取其中3个转化子进行雪莲愈伤组织的悬浮培养，分别测量其在4、8、12、16 d的平均干重及总黄酮含量的变化如图7所示，随着悬浮培养时间的增加，雪莲愈伤组织的干重和总黄酮含量不断增加，在第 12天左右干重及总黄酮含量的增加幅度开始变小 (图7)；其中转基因愈伤组织的总黄酮含量是非转基因愈伤组织总黄酮含量平均值的2.06倍。

3 讨论

尽管花青素代谢途径中的多个结构基因已经从水母雪莲中分离出来[15-17]，但是国内外未见报道天山雪莲中花青素代谢途径的关键酶基因3GT的研究，该文首次从天山雪莲中克隆得到3GT基因。本研究通过同源克隆的方法从天山雪莲叶片中分离得到3GT基因全长序列，根据推测的蛋白质序列分析基因的功能，运用同源转化的方法验证了转基因雪莲愈伤组织中的总黄酮含量比对照有显著提高，这一结果与王庆菊等[18]在对紫叶稠李叶片和张剑亮等[19]在向日葵的研究 3GT基因的过表达能够显著提高植物中黄酮类物质的积累这一研究结果一致。

近几年国内外研究学者对糖苷代谢的研究不断深入。花青素糖基转移酶 (GT) 对于植物花色和花青素的稳定性及可溶性很重要，是因为其决定了糖基化的位置。植物的次生代谢过程中糖基转移酶具有很严格的糖附属物的选择性[20]。多数花青素的糖基化是通过葡萄糖转移酶类的3GT实现的。目前研究报道的植物GTs多为将底物通过 C-或者 N-糖基化形成稳定的代谢产物。天山雪莲的3GT与其他物种的3GT在C端具有相似性，能够识别相同或相似的受体，而N端的相似性远远低于C端，说明天山雪莲花青素的糖基化可能主要为C-糖基化。天山雪莲3GT和各种植物糖基转移酶的进化树表明，天山雪莲3GT与不同物种的 3GT亲缘关系较近，与毛杨梅的3GT相似性较高。

3GT基因的表达具有品种和时间特异性，3GT基因仅在红皮葡萄品种Vitis vinifera中表达[21]，在龙胆Gentiana triflora中，只能在花瓣中检测到3GT基因的表达，在白色花中很少表达[22]。当 3GT基因被抑制表达时，组织培养的葡萄细胞中花色苷的含量明显降低[23]。天山雪莲3GT基因在叶及愈伤组织中表达量最高，在根中表达量较少，在茎中几乎不表达，对该方面具体机理还有待进一步研究。

目前，在GTs家族中还有95%的基因及蛋白还不知道其功能和特征，这就为研究学者们提出了极大的挑战。对天山雪莲3GT基因功能的初步研究中，转基因愈伤组织中总黄酮的含量较野生天山雪莲总苞高2.47倍，天山雪莲3GT是雪莲黄酮代谢途径中的一个关键酶，能够促进黄酮类物质在天山雪莲细胞内的积累，这与前人的研究结果一致，因此，该基因在雪莲总黄酮合成过程中起着重要的作用。运用基因工程手段将天山雪莲自身的 3GT基因转化进入天山雪莲愈伤组织中能够提高天山雪莲总黄酮的合成能力，这将为今后对实现天山雪莲黄酮类物质的人工合成方面的研究奠定基础，是解决天山雪莲资源匮乏的有效方法之一。

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