白芍提取物HPLC指纹图谱分析

姜代勋，陈益山，巩忠福，穆 祥，陈 武

［1．北京农学院兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 昌平 102206；2．中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081］

白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall．）的干燥根，性微寒，味苦、酸，入肝经。具有平肝止痛、养血调经和敛阴止汗等功效，主要用于头晕、胁痛、腹痛、四肢挛痛、血虚萎黄、月经不调、自汗等证［1］，为中（兽）医临床上最常用的中药之一。现代研究表明，白芍具有抗炎、镇痛、免疫调节等多种药理作用［2－4］，其中，以白芍的抗炎作用研究引人注目［5－9］。

研究表明，白芍提取物为高效PDE4活性抑制剂［10］。通过抑制PDE4活性，可使多种炎症和免疫细胞（如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞及嗜酸性粒细胞等）c AMP达到足以抑制炎症细胞活化的浓度而发挥抗炎作用。白芍提取物虽经多步操作制作而成，但对其内部成分和含量仍然未知，因此难于控制其质量。为了使其内部成分及含量以“图谱”形式反映出来，本试验通过用HPLC方法建立了白芍提取物的指纹图谱，为全面控制其质量并为兽医临床开发新型、高效、低毒副作用的纯天然抗炎中药积累资料。

1 材料与方法

1．1 主要仪器和试剂 安捷伦1100高效液相色谱，色谱柱Eclipse XDB-C185μm，4．6×150 mm，Millipol超纯水仪，日立SCR20BA高速冷冻离心机，上海精密p HS-2C型精密酸度计，ACCULAB分析电子天平。色谱乙腈（Merck），芍药苷标准品（中国药品生物制品检定所），其他化学试剂均为分析纯。

1．2 白芍提取物的制备 白芍提取物参考以前的方法制备［8］。简言之，即以蒸馏水煎煮提取2次，合并煎液减压浓缩；加入3倍量95%乙醇，充分搅拌于4℃静置；滤取上清液用氢氧化钠调p H值至7．5～8．0，再次静置；滤取上清液，挥发掉乙醇，将药液浓缩至1 g生药／m L。

1．3 白芍提取物指纹图谱分析 白芍提取物指纹图谱分析参考张克荣等人的方法［11］，对白芍提取物指纹图谱的检测条件及其稳定性等进行研究。

1．3．1 溶液制备 精密称取芍药苷标准品适量，用甲醇配制成0．25 mg／m L的溶液。白芍提取物用流动相稀释至10 mg生药／m L，摇匀，0．22μm微孔滤膜过滤备用。

1．3．2 检测波长选择 取标准品和样品溶液，分别在210 nm、230 nm、254 nm和270 nm共4个波长处检测，同时对其进行190 nm～400 nm的全波长扫描。1．3．3 色谱条件 色谱柱Eclipse XDB-C18 5μm，4．6×150 mm。HPLC分析流动相为乙腈和水（12／88）。流速0．8 m L／min，柱温25℃。

1．3．4 方法学考察 根据文献［12-13］等分别对液相色谱的精密度、样品的重复性及稳定性等进行检测。

2 结果

2．1 运行时间 依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，考察了运行时间为120 min的HPLC图谱，确定60 min之后再无峰出现，因此，确定每次色谱的运行时间为60 min。

2．2 HPLC精密度试验 取新制备的白芍提取物样品，连续进样5次，记录指纹图谱，考察色谱精密度。结果表明，5个主要色谱峰相对保留时间和峰面积比值均无明显变化（RSD≤2．49），符合指纹图谱技术要求（RSD均在3以内），表明仪器具有良好的精密度。结果见表1。

2．3 白芍提取物重复性试验 取同一白芍饮片，称取5份，以相同方法制备进行测定，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明，5个主要色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值没有显著变化（RSD≤2．72），达到色谱指纹图谱要求（RSD在3以内），提示样品和仪器的重现性良好。结果见表2。

2．4 白芍提取物稳定性试验 取一新制备的白芍提取物样品，分别在0、12、24、48、72 h进样，记录指纹图谱，检测样品的稳定性。结果表明，各5个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致（RSD≤2．96），符合指纹图谱要求（RSD 在3以内），表明样品的稳定性良好。结果见表3。

表1 HPLC精密度试验结果

表2 白芍提取物重复性试验结果

表3 白芍提取物稳定性试验结果

2．5 白芍提取物指纹图谱 见图1、2。

由图1可见，白芍提取物主要存在峰1至峰5共5种成分，其中第4峰经与对照品芍药苷比较鉴定为芍药苷。210 nm、254 nm、270 nm处各色谱图与230 nm检测结果基本一致，但峰面积、峰高较小，不能准确积分，而以230 nm检测，峰面积、峰高较大，峰数多，故最适合作白芍提取物指纹图谱的检测波长。

由图2可知，白芍提取物5种主要成分紫外吸收图谱类似，提示其存在同一官能基团。

3 讨论

中药成分复杂，以少数指标性成分控制产品质量不能体现其整体性，因而如何对中药制剂进行整体质量控制是目前中药研究的热点问题［14］。中药的质量控制是中药现代化的一个重要组成方面，中药指纹图谱作为中药质量稳定性的重要检定方法，在中药制剂的质量评价和中药生产的质量控制中有着广泛的应用［15－16］。指纹图谱技术可整体上反应内在成分的情况，有可能最大化的获得药品内在质量的信息，并可指导生产企业对原料、半成品及成品进行质量控制，将中药制剂成分含量的波动控制在一定范围内，尽可能缩小各批次间的差异，以保证产品质量的稳定和均一。

白芍主要含有芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、去苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷等单萜苷类；没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、儿茶素、五没食子酰葡萄糖等鞣质类成分［17］。此外，尚含有苯甲酸、β－谷甾醇、挥发油、脂肪油、树脂、糖、淀粉、黏液质、蛋白质和三萜类成分。

根据试验结果，色谱仪的精密度、白芍提取物样品的重复性及稳定性均符合指纹图谱要求。由图可见，白芍提取物在不同波长各峰分离度均较好，但以230 nm检测，峰面积、峰高较大，峰数较多。从指纹图谱可见白芍提取物主要存在5种成分，因仅获得标准品芍药苷，鉴定出第4峰为芍药苷，其他4种成分正在进一步鉴定中。另外，我们通过试验发现芍药苷对PDE4活性影响较小，因而其余4种成分的分离及鉴定有助于从白芍提取物中发现新的高效PDE4活性抑制剂，有利于新型抗炎药的研发。鉴于白芍提取物在动物炎症模型上显示的良好抗炎作用［8－9］，提示其有望成为用于兽医临床的一种新型纯中药抗炎药，但对于它的安全性及其临床疗效等仍需进一步研究。

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