益精灵口服液质量标准研究＊

(第三军医大学第三附属医院野战外科研究所药剂科，重庆 400042)

益精灵口服液由何首乌、枸杞子、补骨脂等中药组方，有健脑安神、滋补肝肾、调节内分泌以及预防感冒等作用，能治疗无眠多梦、健忘、腰酸膝软、神疲乏力及更年期综合征、早衰等症，近期研究表明其对辐射损伤也有一定的保护作用。该方为本院自制制剂，临床已应用多年，但未对其进行定量控制。为更好地控制该药的质量，以何首乌中大黄素、补骨脂中异补骨脂素为定性指标，并采用高效液相色谱法对方中君药何首乌的有效成分二苯乙烯苷进行含量测定研究，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Sartorius BT 25S型电子分析天平(德国赛多利斯);DU－800型紫外分光光度计(美国贝克曼公司);RE－201C型恒温水浴锅，SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);RE5298A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KQ－50B型超声波清洗仪(昆明市超声仪器有限公司)。二苯乙烯苷对照品 (批号为110844－200908)，大黄素对照品 (批号为 110756－200110)，异补骨脂对照品(批号为110738－200309)，均来自中国药品生物制品检定所;益精灵口服液(第三军医大学大坪医院自制);甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

何首乌:取本品 20 mL，加醋酸乙酯 20 mL，盐酸 0.5 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加1 mL醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。除何首乌外，其余药材按处方比例取一定量，按益精灵口服液制法制成一定体积的溶液，取溶液20 mL，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－醋酸乙酯－甲酸(20∶2∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰。结果见图1 A。

补骨脂[1]:取本品10 mL，加入醋酸乙酯20 mL，0.5 mL盐酸，超声处20 min，分离，取醋酸乙酯层，挥干，残渣加0.5 mL醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液。另取异补骨脂素对照品，加醋酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取除补骨脂外，其余药材按处方比例取一定量，照益精灵口服液制法制成一定体积的溶液，取该溶液20 mL按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL点于硅胶G薄层板上，以正己烷－醋酸乙酯(3∶1)为展开剂，展开，取出，充分晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯(λ=365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液无干扰。结果见图1 B。

图1 薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－水(22∶78，V/V);柱温:25℃;检测波长:320 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL。

2.2.2 溶液配制

精密称取二苯乙烯苷对照品1.6 mg，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为160 μg/mL的对照品溶液。精密量取益精灵口服液2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再用甲醇按 1 ∶1 稀释，摇匀，用 0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。按益精灵口服液处方比例取缺何首乌药材制成溶液，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

图2 高效液相色谱图

2.2.3 系统专属性试验

分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按2.2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图。二苯乙烯苷对照品溶液色谱的保留时间约为10 min，供试品溶液色谱中的二苯乙烯苷与其他杂质分离度良好，分离度大于 1.5，保留时间约为 10 min，阴性对照品溶液色谱在二苯乙烯苷相应位置处无干扰，结果见图2。

2.2.4 方法学考察

线性关系考察:精密吸取对照品溶液，置10 mL棕色容量瓶中，配制得 9 个不同梯度的溶液(0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160 μg/mL)，依次精密进样 10 μL，在 2.2.1 项下色谱条件进样分析。以峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标(μg/mL)进行线性回归，得回归方程 A=31.75C－3.56，r=0.999 9(n=9)。结果表明，二苯乙烯苷质量浓度在0.625～160 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精 密 度 试 验 :取 高 (160 μg/mL)、中 (10 μg/mL)、低(0.625 μg/mL)3 个质量浓度的对照品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件，于1 d之内连续进样5次，以及连续3 d分别进样，计算各成分质量浓度的 RSD。结果日内精密度 RSD＜1.91%(n=5)，日间精密度 RSD＜2.97%(n=3)。

重复性试验:取同一批号(批号为20100622)的益精灵口服液6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样。结果二苯乙烯苷的平均含量为10.52 μg/mL，RSD为1.69%(n=6)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，于制备后分别放置0，1，2，3，4，5 h，按 2.2.1 项下色谱条件进样。结果峰面积的 RSD=2.24%，表明供试品溶液在5 h内基本稳定。

加样回收试验:精密称取9份已知含量的样品，每3份为1组，分别精密加入质量浓度为850 μg/mL的对照品溶液2.0，1.0，0.5 mL，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)

2.2.5 样品含量测定

取样品(批号为20101215)，依法制备供试品溶液并进样测定，结果样品中二苯乙烯苷平均含量为8.38 μg/mL(n=3)。

3 讨论

本制剂由多味药材提取制成，样品成分复杂，经反复试验筛选和研究，选择了上述几种无干扰且重复性好的药味进行定性鉴别，提取和鉴别方法鉴别有效。本品的薄层色谱鉴别均作了阴性对照试验，结果表明各薄层斑点不受样品中其他各药的干扰，专属性较强，简单易行，经多批样品验证，均能检出于对照品相同的斑点，为本制剂提供了比较全面准确的质量控制方法。

二苯乙烯苷极不稳定，见光易分解，曾尝试采用薄层色谱法，但效果不甚理想。在综合了2010年版《中国药典》[2]及相关资料[3－5]后采用高效液相色谱法测定其含量，方法简便、准确，可有效控制其质量。

[1]徐以亮.补骨脂配方颗粒质量标准研究[J].中国药业，2008，17(9):20－21.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:22.

[3]谢 岱，卢全德，余南才.高效液相色谱法测定复方伸筋片中大黄素的含量[J].中国医院药学杂志，2008，28(9):1 752－1 726.

[4]粟力杰.HPLC法测定何首乌中二苯乙烯苷的含量[J].中国当代医药，2010，17(18):41－42.

[5]房志坚，周洪波，肖树雄，等.HPLC法测定活络止痛颗粒中二苯乙烯苷的含量[J].中成药，2009，31(7):1 144－1 145.