诱导大麦LEA蛋白的抗旱基因及Eibi1基因研究进展

周元成 董双全

(山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000)

干旱胁迫是作物生产的主要非生物逆境之一，它严重影响农作物的品质、产量和栽培范围。通过挖掘作物自身的抗旱、耐旱机理，以科学的手段和方法培育优良的耐旱作物品种是从根本上解决这一问题的有效途径。大麦具有早熟、耐旱、耐盐碱、抗黄矮病等多种优良性状，本文主要介绍大麦耐旱基因即HVA1基因、HDCS1基因、脱水素 (DHNs)、角质层基因Eibi1的结构、功能及其诱导和表达，同时简述大麦抗旱基因在转基因育种工程中的应用，并对大麦抗旱遗传育种的发展提出建议。

1 大麦抗旱基因的结构和功能

1.1 脱水素 (DHNs)的结构和功能

LEA蛋白即高等植物胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryo.genesis abundant proteins，LEA proteins)是种子发育后期产生的一类小分子特异多肽。有研究表明，LEA蛋白可在细胞层面上保护植物免受干旱胁迫损伤。脱水素 (Dehydrins，DHNs)是一类水溶性脂质联合体蛋白，属于第2组LEA蛋白 (LEA D-11)，其共同特征是C-端富含赖氨酸，由15个氨基酸组成的保守序列，即EKKGIMDKIKEKLPG(也称K.片段);通常N端有一保守基序Y-片段，二者之间还有一可被磷酸化、由6个丝氨酸串联的S-片段。Egerton-Warburton LM等通过免疫学检测发现脱水素在细胞核和细胞质中都有分布，这与其他LEA蛋白是不同的。Danyluk等通过对小麦的膜系统的研究，认为脱水素对逆境胁迫保护膜系统稳定性至关重要［1］。Compbell［2-3］等总结前人经验，根据氨基酸序列特征推测了脱水素的生物学功能: (1)在非生物逆境胁迫细胞失水情况下，维持植物细胞内膜系统的结构稳定性，(2)细胞失水渗透压增高时，细胞内多余的游离离子将被吸附，减小离子对植物细胞的伤害;(3)和其他功能蛋白结合，在干旱胁迫下维持其他蛋白质的正常结构和功能，保证植物正常生理代谢功能的继续。目前在大麦基因组中已描述DHN基因达13个，推测于大麦耐旱相关最为紧密的脱水素基因为DHN4、DHN6。经测定，DHN4位于大麦的第6H染色体上，DHN6位于4H染色体上。DHN4为YSK2型脱水素，其编码区长为678 bp，二级结构易形成 a-螺旋，通过SWISS-PROT预测DHN4的三级结构，结果显示它并没有固定的三维结构，这使DHN4能更易于与生物膜结合从而稳定生物膜，防止细胞内水分的过度流失，维持膜结构的水合保护体系，防止膜脂双分子间距减小，进而阻止膜融合以及生物膜结构的破坏［1，4］。杜俊波等［5］用 RT-PCR 的方法从青稞中克隆到了脱水素基因DHN4，且通过实验验证了这一观点，并由此推断DHN4在青稞的抗旱能力方面起到了重要的作用;DHN6基因序列全长为1767 bp，含一个92 bp内含子，90～1759 bp为一个开放阅读框，编码523个氨基酸残基的多肽，预测蛋白质的分子量为49.68 kDa，理论等电点为8.04。结构分析发现，DHN6具有3个螺旋区，无规则卷曲构成二级结构的主要组分，亲水氨基酸比例超过83%;三维结构预测发现，多肽链自身反向平行排列成松散的亲水索链，K片段参与兼性。螺旋结构域的形成，意味着该脱水素具有束缚自由水、稳定细胞膜相结构的功能。实时定量RT-PCR检测结果表明，DHN6基因的相对表达水平在干旱处理8 h快速累积，推测DHN6在大麦对干旱胁迫的早期响应中发挥重要功能［6］。

1.2 HVA1基因的结构和功能

目前国内外众多学者对大麦HVA1基因的表达与调控、高同源性序列的克隆以及转HVA1基因植物抗旱性功能验证等方面开展了深入广泛的研究。大麦HVA1基因所编码的蛋白属于Lea蛋白的第3组，有研究证明，第3组LEA蛋白在种子成熟，干燥和渗透胁迫条件下可保护细胞免受水势降低的损伤。HVA 1基因位于大麦的第5条染色体上，编码区全长642 bp，含213个氨基酸残基的蛋白质，富含Ala、Thr、Lys。HVA 1编码的蛋白质包括9个重复的不完整的11个氨基酸组成的保守基元序列:Thr-Glu-Ala-Lys-Gln-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr。其上游启动子区域含有在ABA诱导基因中保守的序列元件:三个pABRE序列和C盒。研究发现，C盒和 pABRE 1突变不会影响HVA1基因的转录水平，高水平HVA1基因的表达依赖于 pABRE 2 和 pABRE 3［7］。

1.3 HDCS1基因的结构和功能

二棱大麦HDCS1基因编码202个氨基酸，含有8个由11个氨基酸残基组成的基序列。与大麦HVA1基因属高同源性序列。将它们的核苷酸序列及其所编码的蛋白质氨基酸序列进行同源性分析。结果显示，HDCS1的664个核苷酸残基与HVA1相比，HDCS1缺少了C339-C431的33个核苷酸，同样也缺少相应的Thr122-Ala132的11个氨基酸残基，这11个氨基酸是一个完整的基元序列。也就是说HDCS1比HVA1仅缺少一个基元序列，其他部分完全相同。HDCS1基元序列呈α-螺旋结构，具有亲水亲脂兼性，根据第3组LEA蛋白的结构特征及HDCS1的结构，可以推断HDCS1是形成第3组LEA蛋白高级结构的基础［8］。

1.4 角质层基因Eibi1

陈国雄等［9］，以野生大麦和水稻为试验材料，克隆角质层基因Eibi1，该基因与叶片角质层保水功能密切相关。角质层基因Eibi1编码ABCG全转运子，把角质成分从细胞内运转到叶片表面形成功能性角质层。Eibi1基因编码ABC转运蛋白G亚家族的一个全转运子HvABCG31，DNA序列全长l1693 bp，位于大麦染色体3H上，其表达主要出现在苗期伸长区的幼叶组织中。角质层基因Eibi1的抗旱机理与前文所述基因有所不同，它主要是调节叶片表面角质层的厚薄来完成抗旱胁迫功能的。其调节机理如下:Eibi1基因功能的缺失会导致叶片表皮细胞中脂质成分的大量积累.叶片表面角质层变薄，角质含量减少，同时角质层结构不完整，叶片失水快，保水抗旱能力差。

2 大麦抗旱基因诱导与表达

研究显示，HVA 1基因的表达与多种因素有关。在种子发育期间，HVA1基因的mRNA在糊粉层及开花25 d的胚中积累，在干种子的糊粉层中保持较高水平，而在淀粉质胚乳细胞里未检测到。这说明HVA1基因的表达受种子发育水平的调节。大麦种子在休眠和未休眠的状态下，HVA1 mRNA在干胚里的含量是相同的，但吸胀后，休眠胚HVA1 mRNA下降的速度比未休眠的要慢，打破种子休眠，则导致HVA 1mRNA的消失。这说明休眠和水份都对HVA1基因的表达有调控作用。另外，HVA 1基因的表达还受干旱、NaC1、寒冷或热处理及ABA等诱导表达。如Bimei Hong(1992)等人干旱处理24 h或冷处理4 d后HVA1的转录有很大的提高，但热处理4 h或1%NaC1处理3 d后转录水平仅有少量增强［7］。

脱水素 (DHNs)基因的表达受干旱、NaC1、脱落酸 (ABA)、赤霉素 (GA)、水杨酸 (SA)、茉莉酸 (JA)、伤害、紫外线、重金属、光周期等因素的调控［10］。有研究表明，脱水素的表达累积水平随着环境胁迫的时间延长而升高。如钱刚等(2011)［6］通过实验证实大麦Dhn6基因的转录水平随着干旱胁迫时间的延长升高。也有研究证明，在大麦发现13个脱水素中，并非所有的脱水素基因都被干旱胁迫诱导表达［11］，Tommasini等［12］发现大麦脱水素 Dhnl、Dhn2、Dhn3、Dhn4、Dhn7、Dhn9和Dhnl0受干旱胁迫后在胚芽，中胚轴和种子根部的表达量上调，但不受低温胁迫;Dhn5、Dhn8和Dhnl3受干旱和低温胁迫的诱导;Dhn6、Dhnl1和Dhnl2既不受干旱也不受低温胁迫的诱导，它们主要在胚胎中表达。Choi等发现Dhnl2基因只在种子发育成熟过程中特异表达，而且，随着干旱胁迫时间的延长。同时有研究表明，即使相同的LEA蛋白基因在抗旱性不同的大麦参试材料中的表达累积也有所不同［13-14］，Suprunova等［15］在测定了大麦离体叶片失水率的基础上，检测了脱水素的早期转录累积水平，发现脱水素在抗旱性不同的大麦材料表达累积也存在差异。这些结果都说明不同的脱水素在应对植物干旱胁迫时应答机制并不相同，这可能是由于基因的顺式作用元件不同而引起的差异。

3 抗旱基因工程育种

HVA1基因具有较强的抗旱功能，在农业生产中有非常广泛的应用价值。自1988年Bimei Hong等人发表大麦HVA 1基因cDNA序列的文章发表以来，国内外众多学者根据大麦HVA1基因的cDNA序列克隆出其它作物中与其同源性较强的序列，或者把大麦HVA1基因转入其它作物获得抗旱的转基因植株。除比较早的Deping Xu(1996)、Sivamani(2000)等人通过转基因技术获得了转基因植株外，近几年，冀俊丽 (2002)、刘祥久等(2005)、李楠等 (2007)也都用不同的技术方法相继获得了转基因株系［7，16］，并得到了一定的抗旱效果。国外也有人将HVA 1基因的cDNA导入到燕麦中，从而获得了耐旱、耐盐的转基因燕麦。

二棱大麦 HDCS1的基因、大麦 DHN4和DHN6基因以及角质层基因Eibi1三个抗旱基因方面，由于研究开展较晚，且一些抗旱机理尚不明确或处在推测阶段，它们的转基因利用还未见报道。

4 展望

提高大麦对干旱、低温、盐碱等非生物胁迫的抗性，改良其对环境的适应性，一直是大麦育种工作的一项艰巨任务。大麦抗旱基因的发现与研究对大麦育种工作意义重大，利用分子遗传育种技术和转基因技术，可以获得抗旱性较强、品质较好的大麦品种，大大改善大麦对环境不利因素的耐受性，使其可以在干旱的环境下良好地生长，从而提高大麦的产量和播种面积。但从目前大麦抗旱基因研究上看，仍存在很多不足之处，如大麦脱水素的具体功能和作用机理还没有统一的认识;角质层基因Eibi1基因也是新近才发现，其功能和作用的研究也都是起步阶段;大麦抗旱基因在近缘种属间的遗传改良和基因诱导、表达等方面的研究还需不断深入。随着大麦抗旱基因研究的发展，以及植物抗旱分子机制的研究和生物技术的日臻完善，大麦抗旱基因将得到更深层次的开发和利用，为抗旱基因工程的研究提供有力的平台，也必将为获得高效的抗旱植株、解决干旱胁迫等问题带来新的希望。

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