杆状病毒表达载体在医学领域中的应用进展

单士刚，包永芬，陈贤均

(咸宁学院基础医学院，湖北咸宁437100)

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞系。真核细胞系统包括哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。其中昆虫细胞表达系统，即杆状病毒表达系统(BEVS)，因其独特的生物学特性，在过去的20年里，已作为一种真核表达载体被广泛应用。本研究就该系统的主要特性、种类以及在医学领域中的应用等方面进行阐述。

1 杆状病毒及其表达系统

杆状病毒是一类专门寄生于节肢动物的病原微生物。目前全世界已发现600多种杆状病毒，其中研究最深入的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)。AcNPV病毒粒子成杆状，病毒囊膜直接包被着约130 kb的双链、环状DNA分子，其全基因组序列已经测定清楚。20世纪80年代后期昆虫杆状病毒已被成功开发作为一种基因表达的载体，即昆虫杆状病毒基因表达系统。目前其被广泛应用于外源目的基因的表达。由于利用真核的昆虫幼虫或昆虫细胞作为宿主，其表达的蛋白质能够进行正确的转录后加工;杆状病毒基因组本身较大且可操作性好，可以容纳多个基因或较大的基因，而且杆状病毒在自然条件下不能感染脊椎动物，生物安全性好，这些优点使杆状病毒基因表达系统成为一项比较成熟、安全、经济、高效的蛋白质表达技术［1］。经历几十年的发展，围绕扩大杆状病毒表达体系的应用范围，科学家们对此体系进行了一系列的改造。截止到目前，已有19种商品化的杆状病毒表达体系得到广泛应用［2］。

2 杆状病毒表达体系在医学中的应用

2.1 作为基因治疗载体 到目前为止人类已经发现27种非人类病毒载体可用于临床疾病的治疗［3］，其中杆状病毒是非复制型载体，且重组杆状病毒载体具有容量大、易操作、易纯化和安全性高的特点，因而是一种很有应用前景的基因转移载体［4］。自首次报道运用杆状病毒介导的p53基因治疗骨肉瘤以来，已有许多利用杆状病毒基因转移技术进行心血管、前列腺、肿瘤、神经系统等疾病的治疗研究。新近发现杆状病毒还是潜在的、长期的、高效的体内转移基因载体。Pieroni等将杆状病毒注射到不同鼠种的后四头肌中时，报告基因得到了表达，一些鼠种的报告基因甚至表达了35～178 d。这使杆状病毒在基因治疗方面更具有应用潜力。最近，有研究肯定了用含有白喉毒素基因的杆状病毒对于神经胶质瘤治疗的效果［5］;通过杆状病毒介导在人胚胎干细胞内也获得了瞬间和稳定的基因表达［6］，并且研究表明杆状病毒能够作为用于干细胞和骨组织工程中的新型基因转移载体［7，8］。为了更好地发挥杆状病毒在哺乳细胞中的作用，有学者对杆状病毒载体进行了改良。用含有巨细胞病毒(CMV)启动子和绿色荧光报告基因(gfp)的病毒进行有效的杆状病毒介导性转导，已在一系列细胞系和原代培养物中证实;另一种能有效并稳定地将重组基因导入细胞的杆状病毒载体也已报道。这种病毒含有1对表达盒(B-gal和潮霉素抗性)，并以来自腺病毒伴随病毒(AAV)的倒置末端重复序列(ITR)为侧翼［9］。

总之，重组杆状病毒作为基因转移载体应用于哺乳动物细胞已经得到广泛证实。杆状病毒通过一种尚未阐明的侵入机制，使其成为一个能对许多哺乳动物细胞系进行高效转移的载体。但许多问题，特别是体内转导及其机制等需要进一步研究和解决。

2.2 作为基因表达载体用于疫苗研制 杆状病毒表达系统由于其不具有任何对哺乳动物有潜在致病性的动物病毒片段，得到了人们的高度重视，被越来越多的应用于多肽药物和疫苗研制方面［10］。目前，杆状病毒表达载体已用于多种疫苗的生产研制，主要集中于病毒和寄生虫疫苗，如HIV疫苗已于20世纪80年代进入临床，疟疾疫苗已于20世纪90年代进入临床。与这两种疫苗相比，针对细菌感染的基因工程疫苗则研究报道较少。相信随着时间的推移，BVES系统用途会得到更大扩展。

2.3 作为生物纳米材料 近几年来的研究致力于将生物学的工具用于纳米科技领域，即将生物学应用于纳米科技，从而产生了生物纳米技术。生物学材料可能是仿生纳米级物体的独特工具，有序的纳米级生物分子是仿生无机纳米结构很好的模板。利用生物病毒开发纳米生物技术是近年引人注目、迅速发展的一个领域。杆状病毒自身具有纳米级结构，因此成为生物纳米技术领域中非常诱人的建筑材料。目前虽然有关利用昆虫杆状病毒应用于纳米领域的报道还不多，但已出现一些新的研究动向，如应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内生产SV40核衣壳蛋白，使之进行自我组装，成为一个能够输送生物活性物质的纳米胶囊［11］，有望应用于基因治疗领域。利用杆状病毒产生类似于犬细小病毒新的纳米材料，应用于肿瘤的治疗［12］。

2.4 用于表达免疫活性分子和重组药物蛋白 杆状病毒表达载体自问世以来，由于其不具任何对哺乳动物有潜在的致病性的动物病毒片段，表达的产物成本低、表达量高、构象接近天然蛋白等特点，因此可用于免疫活性分子和重组药物蛋白(如抗原、抗体、生长因子、酶、干扰素等)的大量生产。自1983年首次表达IFN-β以来，已经表达了(如生长因子、酶、干扰素等)大量活性免疫分子和重组药用蛋白，且具有广泛的应用和市场前景。近来，Machado等［13］成功表达了汉坦病毒核蛋白，可用于血清学检测。

2.5 用于基于细胞的药物筛选 长期以来对乙肝病毒的研究由于缺乏一种合适的体外培养系统而受到限制，为此Delaney等［14］发展了一种新的体外表达系统。他们将具有复制性的HBV基因组重组至AcMNPV，用此重组AcMNPV介导HBV基因组进入HepG2细胞系并使其得到高水平复制和表达，由此构建HBV-AcMNPV-HepG2表达系统。并运用此系统评价了抗病毒药物拉米夫定对HBV复制及共价闭合环状DNA聚集的影响。随后Delaney等［15］又将HBV耐药株重组至AcMNPV，并用此重组病毒测试了HBV耐药株对不同药物的交叉耐药性。Adelhamed等［16］报道采用HBV-杆状病毒系统对拉米夫定和Clevudine的抗HBV效果进行了比较。

总之，杆状病毒表达载体具有基因容量大、操作性好、表达效率高、生物安全性好、靶向性强等优点，在医学领域的研究中应用越来越广泛，对医学研究具有重要指导意义。随着生物技术的不断进步，BEVS的研究必将更加深入、完善。

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