杆状病毒载体灭活方法的研究进展

伊立超，娄安钢

（延边大学农学院，吉林 延吉 133000）

杆状病毒基因组为大型环状闭合双链DNA结构，杆状病毒科包含颗粒体病毒属（Granulovirus, GV）和核型多角体病毒属（Nucleopolyhedrovirus, NPV），形态表现为杆状，宽约30～60 nm，长约250～300 nm，主要以包涵体来源病毒（Occlusionderivedvirus, ODV）和出芽型来源病毒（Buddingvirus, BV）[1]。

昆虫细胞杆状病毒表达系统（Insect cellbaculovirus expression system, IC-BVES）的应用越来越广泛，特别是在抗体研发、疫苗生产、生物防治[2]方面都有较多的研究和相关成果。在疫苗研发方面，对重组杆状病毒灭活后进行免疫的研究日趋增加，本文就杆状病毒表达系统、常用杆状病毒灭活方法及免疫效果作以综述。

1 杆状病毒表达系统

1.1 杆状病毒表达系统的主要组分

pFastBac™载体，目的基因的表达由（AcMNPV）多角体（PH）或p10启动子控制，表达框中包含庆大霉素抗性基因和SV40多聚腺苷酸化信号，以形成mini-Tn7。DH10Bac™大肠杆菌作为载体的宿主菌，细胞中含有杆状病毒穿梭载体（杆粒）和辅助质粒。pFastBac™表达质粒转入DH10Bac™细胞后，mini-Tn7元件与杆粒上的mini-atTn7靶位点之间发生转座（辅助质粒提供了转座蛋白）。

1.2 杆状病毒表达系统的主要特点

作为真核表达系统，杆状病毒表达系统与原核表达系统和其他真核表达系统相比，有其独特的特点：

（1）表达效率高。重组杆状病毒能在昆虫细胞系及昆虫体内高效表达目的蛋白[3]，最高可达细胞总蛋白的50 %，表达量高是其重要特点。

（2）基因容量大。双表达载体可以表达两段不同的外源基因，也可用不同的重组杆状病毒同时感染昆虫细胞表达不同目的蛋白。另外杆状病毒基因组在核衣壳内折叠延伸，可以容纳较大外源基因插入[4]。

（3）翻译后加工修饰充分。杆状病毒表达系统可对翻译后的蛋白进行磷酸化、糖基化[5]、信号肽切除等修饰，使蛋白接近天然产物并提高其生物学活性。

（4）生物安全性高。杆状病毒感染具有很高的种属特异性，只感染昆虫等节肢动物，对哺乳动物及周围环境无害[6-8]。

1.3 杆状病毒表达基本流程

将目的基因克隆至pFastBac™供体质粒，生成pFastBac™重组体，将重组体转化入DH10Bac™细胞中，获得含有重组杆粒的大肠杆菌集落，可再次涂布集落以确认其中含有重组杆粒，将含重组杆粒的集落接种到培养基中培养过夜，提取重组杆粒DNA，采用Cellfectin®Ⅱ试剂转染昆虫细胞，获得P1重组杆状病毒库，感染昆虫细胞扩增病毒，获得至P3重组杆状病毒库，滴定测得重组杆状病毒滴度后感染悬浮昆虫细胞，获得重组杆状病毒。

2 常用杆状病毒灭活方法

2.1 甲醛灭活法

甲醛灭活原理是使微生物的蛋白质、核酸变性，导致微生物死亡，不再有感染性，但不明显影响其免疫原性。

胡波[9]将兔出血症病毒VP60基因构建到pFastBac™1供体质粒上，获得P3重组杆状病毒库之后，按照体积比1 % 接种感染悬浮SF9昆虫细胞，培养5 d后收获细胞培养物，加入终浓度0.2 % 的甲醛溶液灭活24 h，灭活后将细胞培养物接种于SF9昆虫细胞中，培养5 d盲传一代后，检测细胞培养物血凝性，验证是否灭活完全。

2.2 β-丙内酯（BPL）灭活法

β-丙内酯（BPL）直接与病毒核酸作用，而不作用于壳蛋白，不破坏病原体的免疫原性。

肖琦[10]将圆环病毒2型cap基因构建到pFastBac™Dual供体质粒上，获得P3重组杆状病毒库之后，按照最佳感染复数1 MOI接种感染悬浮High Five昆虫细胞，培养5 d后收集细胞培养物，-20 ℃ 反复冻融3次，加入终浓度0.50‰β-丙内酯，置于4 ℃ 振摇12 h，灭活后37 ℃ 水浴2 h去除β-丙内酯。按照体积比1 % 将灭活后的细胞培养物接种于SF9细胞中，培养5 d后观察细胞病变情况，细胞有病变则将细胞培养物-20 ℃ 反复冻融3次后进行蛋白表达鉴定；无病变则将细胞培养物 -20 ℃ 反复冻融3次后再次接种，到第3次之后进行蛋白表达鉴定，验证灭活完全。

3 结论

文章对杆状病毒表达系统及重组杆状病毒灭活方法进行了综述。制备动物灭活病毒疫苗应用最广泛的传统方法是用甲醛[11]，但对免疫动物有一定的应激性[12-13]。最近β-丙内酯的灭活研究较多，其灭活效果比甲醛强25倍[14]，一定剂量对动物有致癌性，但在37 ℃ 环境中其极易水解为无毒性物质[15-16]。杆状病毒表达系统的应用越来越广泛，合适的灭活方法和灭活条件需要更多尝试，其中最关键是是灭活完全及减少重组杆状病毒的损失。