芒柄花黄素对超氧阴离子及羟自由基清除作用的研究＊

叶雨 陈健

（1.广西医科大学第一附属医院西院急诊科，广西 南宁 530021；2.桂林医学院基础医学院生理教研室，广西 桂林 541004）

芒柄花黄素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是红三叶草的主要活性成分之一，红三叶草为豆科多年生牧草，原产于小亚细亚与东南欧，广泛分布于温带及亚热带地区。我国广西、云南、贵州有野生种。芒柄花黄素具有保护心血管，抗病毒，抗肿瘤等作用［1－4］。本研究组的前期研究表明，芒柄花黄素具有抑制前列腺癌细胞增殖，诱导凋亡的作用［5］。本研究拟探讨芒柄花黄素在体外对邻苯三酚氧自由化产生的超氧阳离子自由基（）和由邻二氮菲－Fe2＋／H2O2体系产生的羟自由基（·OH）的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及试剂

芒柄花黄素（纯度＞98%），购自天津马克生物技术有限公司，溶解于二甲基亚砜配置成200M的储存液，保存于4℃；H2O2，购自成都海兴化工试剂厂；邻苯三酚，购自成都市方舟化学试剂厂，分析纯；邻二氮菲，购自成都市方舟化学试剂厂，分析纯；FeSO4，购自成都市方舟化学试剂厂，分析纯。

1.1.2 溶液配制

PH 7.34的磷酸缓冲液（PBS）用磷酸二氢钾和氢氧化钠配制；PH 8.34的磷酸缓冲液（PBS）用磷酸二氢钾和磷酸氢钾配制。

1.1.3 仪器

Beckman DU640紫外分光光度计，723分光光度计。

1.2 方法

的方法［6，7］，采用如下实验方法：总体积4.5ml的PBS（pH8.34）50mM，邻苯三酚0.2mM，反应温度为25℃，加入一定量芒柄花黄素，测定反应启动后10s时的A322nm值（以同浓度芒柄花黄素作参比）。另取试剂同上，不加芒柄花黄素以作对照，测反应启动后第10s时的A322nm值（用pH 8.34的PBS作为参比）。清除率按下式计算：

反应体系同上。用动态方法测定O2· －生成的反应初速率V0（A.min－1）。反应取得启动后每30s测相应 A322nm值，至4.5min止。将所得A322nm值与时间t（min）进行回归分析，其斜率为V0。抑制率按下式计算：

1.2.3 ·OH的生成及清除率的测定

按参考文献的方法［6，7］，采用如下实验方法：邻二氮菲0.35mmol·L－1，FeSO40.4mM，pH7.34的 PBS 150mM，加0.015%H2O2（损）或不加 H2O2（未损），37℃保温90min，分别测510nm时的A值，得A损与A未损。邻二氮菲0.35mM，Fe－SO40.4mM，PBS（pH7.34）150mM，0.015%H2O2，加入一定量芒柄花黄素，各加药管以加同浓度的芒柄花黄素作参比，测A510nm，即得A样。·OH清除率按下式计算：

1.3 数据处理

2 结果

表1 芒柄花黄素对O2－的清除作用（，n＝10）

表1 芒柄花黄素对O2－的清除作用（，n＝10）

注：＊＊与对照组比较，P＜0.01。

组 别浓度（μg·ml－1）A322nm O－2清除率（%）对照组 －0.512±0.023芒柄花黄素 10 0.296±0.021＊＊ 42.1920 0.222±0.018＊＊ 56.6440 0.177±0.020＊＊65.43

用动态方法测得反应的初速率V0（A.min－1）。本实验回归的相关系数在0.9968～0.9998之间。加入芒柄花黄素后，使得药物在反应体系里面的终浓度达到10、20、40μg·ml－1，生成速率V0显著减小（结果见表2），表明芒柄花黄素能抑制的生成。

表2 芒柄花黄素对生成的作用（，n＝10）

表2 芒柄花黄素对生成的作用（，n＝10）

注：＊＊与对照组比较，P＜0.01。

组 别浓度（μg·ml－1）Vo（A·min－1）O－2抑制率（%）对照组 －0.161±0.016芒柄花黄素 10 0.111±0.008＊＊ 31.0620 0.089±0.010＊＊ 44.7240 0.059±0.014＊＊63.35

2.3 对·OH的作用

在本试验条件下，按照上述计算公式，由A510nm的测定值观察芒柄花黄素对·OH的清除作用。芒柄花黄素对·OH具有显著的清除作用（结果见表3），其中以高剂量40μg·ml－1最为明显。

表3 芒柄花黄素对·OH的作用（，n＝10）

表3 芒柄花黄素对·OH的作用（，n＝10）

注：＊＊与对照组比较，P＜0.01。

组 别 浓度（μg·ml－1） A510nm ·OH清除率（%）对照（受损） －0.513±0.0189对照（未损） － 1.302±0.028芒柄花黄素 10 0.789±0.021＊＊ 34.9820 0.837±0.019＊＊ 41.0640 0.999±0.017＊＊61.60

3 讨论

我们采用体外实验的方法研究芒柄花黄素对OFR的影响。在邻苯三酚自氧化实验中和有色中间产物生成，而该有色中间产物在322nm处有一特征吸收峰，本实验利用这一特点间接测得生成情况及药物对的清除率，同时，用动态方法测定生成反应的初速度，还可观察药物对生成的抑制情况。结果表明，芒柄花黄素对具有明显清除及抑制作用，并呈剂量依赖性。另一方面，我们通过Fenton反应产生·OH，邻二氮菲－Fe2＋被·OH氧化为邻二氮菲－Fe3＋，其510nm处吸收峰消失，因此，测定此处吸收值的变化可以间接得知·OH的变化情况。当加入芒柄花黄素后，体系的A值增大，表明芒柄花黄素对·OH的生成有抑制作用。联系到我们前期研究成果芒柄花黄素能够抑制前列腺癌细胞的增殖，那么芒柄花黄素防治前列腺癌的作用是否与其清除氧自由基能力有关，机制有待进一步研究。

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