细胞色素P4501B1在子宫内膜癌组织中的表达与ER相关

王 瑾，笪纪平，徐培培，李雪静，程建新，李 利*

（1.河北医科大学第四医院妇科，河北石家庄 050011；2.中日友好医院病理科，北京 100029）

·论 著·

细胞色素P4501B1在子宫内膜癌组织中的表达与ER相关

王 瑾1，笪纪平2，徐培培1，李雪静1，程建新1，李 利1*

（1.河北医科大学第四医院妇科，河北石家庄 050011；2.中日友好医院病理科，北京 100029）

目的检测子宫内膜癌及正常子宫内膜中细胞色素P4501B1（cytochrome P450 1B1，CYP1B1）、儿茶酚氧位甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）的表达差异，探讨其在子宫内膜癌发生发展过程中的意义。方法采用免疫组织化学SP法对40例子宫内膜癌及35例正常子宫内膜组织切片进行染色，使用奥林巴斯公司DP70成像系统完成采图，应用Image-Pro Plus5.1图像分析系统对染色标本进行图像分析处理。结果子宫内膜癌组织腺上皮胞浆中CYP1B1的表达明显高于正常子宫内膜组织（P＜0.05）；而COMT的表达低于正常子宫内膜组织（P＜0.05）。子宫内膜癌组织中CYP1B1表达随雌激素受体表达增强而增强（P＜0.05）。CYP1B1与COMT表达在正常子宫内膜组织中存在正直线相关关系（r=0.384，P＜0.05）。结论CYP1B1在子宫内膜癌的发生过程中起重要的作用，其作用发挥依赖雌激素受体，而COMT起保护性作用。此2种酶共同维持机体内正常的雌激素代谢，防止过多致癌物的产生。

子宫内膜肿瘤；细胞色素P450酶系统；受体，雌激素

子宫内膜癌（endometrial carcinoma）为女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一，约占女性癌瘤的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20% ～30%［1］。近年随着全球妇女人均寿命的延长，雌激素替代疗法的日益增多，其发病率已呈上升趋势。据统计［2］，美国每年约有35 000例新病例，6 500例死于该病。我国虽缺乏大规模的统计学资料，但其上升趋势已显而易见。子宫内膜癌和子宫颈癌的发病率已从20世纪60年代的1∶10变为现今的1∶1［3］。虽然目前子宫内膜癌的病因学研究备受关注，但此病发生机制尚未明确。国际上已有较多的研究资料［4］表明雌激素及其代谢产物儿茶酚雌激素，可引起机体DNA的突变，从而诱发癌症的发生。而雌二醇相关的细胞内代谢主要包括细胞色素P4501B1（cytochrome P450 1B1，CYP1B1）介导的氧化作用（主要为羟化）以及 儿 茶 酚 甲 基 转 移 酶（catechol-O -methyltransferase，COMT）介导的氧位甲基化作用。我们推测这二种酶可能与雌激素依赖性子宫内膜癌的发生发展有关。本研究通过免疫组织化学方法检测CYP1B1和COMT在子宫内膜癌以及正常子宫内膜中的定位及表达，旨在为子宫内膜癌的早期诊治及抗癌药物的研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2007年6月—2008年6月河北医科大学第四医院妇科经手术治疗，术后病理确诊为子宫内膜癌的患者40例，年龄36～70岁，平均（53.00±10.42）岁，根据手术-病理分期，Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期13例；病理分级，1级（高分化）13例，2级（中分化）15例，3级（低分化）12例；浅肌层浸润26例，深肌层浸润13例，无肌层浸润1例。术后病理显示，雌激素受体（estrogen receptor，ER）（-）9例，ER（ +～++）24例，ER

（+++）7例；孕激素受体（progesterone receptor，PR）（-）8例，PR（+～++）25例，PR（+++）7例；p53（-）21例，p53（+）19例。同期收治35例子宫颈癌患者的正常子宫内膜作为对照组，临床和病理排除子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫内膜增生、乳腺癌、卵巢癌等。年龄 36～72岁，平均（52.59±8.03）岁，均无肿瘤和遗传病史。所选病例术前均无放化疗病史，无激素替代治疗史，无吸烟史，年龄之间差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂：兔抗人 CYP1B1抗体（英国ABCAM公司）、兔抗人COMT抗体（美国SANTA CRUz公司）、辣根过氧化物酶标记抗兔/小鼠IgG多聚体（美国GIB公司）、DAB显色剂（丹麦DAKO公司）。

1.2.2 研究方法：免疫组织化学SP法。所有标本均由10%甲醛固定，常规制作3μm厚连续石蜡切片，脱蜡水化，高压修复，染色。

1.2.3 结果判断标准：CYP1B1、COMT在正常子宫内膜及癌组织腺上皮细胞质表达，腺上皮细胞胞质内可见棕黄色颗粒，以细胞两极表达明显。应用OLYMPUS BX51显微镜及DP70成像系统进行采图，Image-Pro Plus 5.1图像分析软件对免疫组织化学染色标本进行计量分析，对每张切片的平均光密度值进行统计学分析，以5个视野的均值作为该切片的最终平均光密度值，平均光密度值相当于阳性区域颜色的平均深浅程度，与着色强度呈正直线相关关系；ER、PR的阳性表达为细胞核呈棕褐色，P53阳性表达亦为细胞核呈棕褐色，每例均随机观察5个高倍视野（10×40），用半定量积分法判断结果，阳性细胞≤5%为0分，6% ～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；阳性强度黄色为1分，棕黄为2分，棕褐色为3分。两者积分相乘，0分为阴性（ -），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0版软件包进行数据分析，计量资料以±s表示，两独立样本均数比较采用t检验，多个独立样本均数的比较采用单因素方差分析，相关性采用 Pearson直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CYP1B1和COMT在子宫内膜癌组织中的表达：CYP1B1、COMT主要在癌组织和正常内膜组织的腺上皮细胞胞浆着色，呈棕黄色，主要分布在细胞两级，表达较为均一（图1）。子宫内膜癌组织腺上皮胞浆中CYP1B1平均光密度值明显高于正常子宫内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。COMT在内膜癌组织中的平均光密度低于正常子宫内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 CYP1B1和COMT在不同手术-病理分期表达：分期越晚，CYP1B1平均光密度越高，早期表达明显低于晚期，差异有统计学意义（P＜0.05）。分期越晚，COMT平均光密度越低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 CYP1B1和COMT表达与ER、PR、p53的关系：在ER（-）、ER（+～++）、ER（+++）3组中，随ER表达逐渐升高，CYP1B1平表达呈逐渐升高趋势，且差异有统计学意义（P＜0.05）；COMT在3组中表达差异无统计学意义。在 PR（ -）、PR（+～++）、PR（+++）3组中，此2种酶表达差异无统计学意义。p53（-）、p53（+）2组中COMT表达差异有统计学意义。见表3，4。

2.4 CYP1B1与COMT的相关性分析：正常子宫内膜组织中CYP1B1与COMT表达存在正直线相关关系（r=0.384，P=0.025）；而内膜癌组织中此2种酶不存在相关性。

表1 病例组与对照组CYP1B1、COMT表达比较Table 1 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases and controls（±s）

表1 病例组与对照组CYP1B1、COMT表达比较Table 1 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases and controls（±s）

*P＜0.05 vs control by t testCYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n CYP1B1 COMT Control 35 0.169±0.184 0.290±0.052 Case 40 0.259±0.044* 0.208±0.058*

表2 病例组不同期别CYP1B1、COMT表达比较Table 2 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases of different stages（±s）

表2 病例组不同期别CYP1B1、COMT表达比较Table 2 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases of different stages（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n 13 0.236±0.038 0.234±0.056Ⅱ14 0.259±0.044 0.207±0.057Ⅲ～Ⅳ 13 0.282±0.039 0.182±0.057 F CYP1B1 COMTⅠ0.027 0.113 3.980 0.363 P

表3 CYP1B1、COMT表达与ER的关系Table 3 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and ER expression（±s）

表3 CYP1B1、COMT表达与ER的关系Table 3 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and ER expression（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol - O -methyltransferase；ER：estrogen receptor

Groups nCYP1B1 COMT ER（-）9 0.245±0.053 0.206±0.067 ER（+～++） 24 0.252±0.037 0.212±0.060 ER（+++） 7 0.301±0.031 0.197±0.047 F 0.016 0.842 4.637 0.177 P

表4 CYP1B1、COMT表达与p53的关系Table 4 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and p53 expression（±s）

表4 CYP1B1、COMT表达与p53的关系Table 4 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and p53 expression（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n CYP1B1 COMT p53（-）21 0.254±0.039 0.227±0.063 p53（+） 19 0.264±0.049 0.188±0.048 t 0.490 0.035 0.697 2.184 P

3 讨 论

CYP1B1是已知的细胞色素P450超基因家族成员之一，为 CYP1B亚族的惟一成员［5］，与其他P450酶的不同之处在于其在正常组织中不出现或表达水平很低，但在多种肿瘤组织中表达过量。CYP1B1主要催化激活 17β-雌二醇（17βestradiol，E2）在C4位点羟化作用，主要的代谢产物4-羟雌二醇（4-OH-E2）发生以下2种反应：一方面在细胞内经氧化作用形成高活性的雌二醇-3，4-醌（E2-3，4-quinone），与DNA中的嘌呤反应形成去嘌呤加合物，DNA由此产生的无嘌呤位点发生突变，最终导致癌症的发生；另一方面4-OHE2在COMT的甲基化作用下生成可溶于水的代谢产物，失去生物学活性排除体外。

本研究发现CYP1B1在癌组织中的表达强于正常内膜组织，与Saini等［6］的研究结论一致。李利等［7］采用Western blot方法研究发现CYP1B1在正常子宫内膜及癌组织中均有表达，并且发现癌组织中CYP1B1的表达量高于正常子宫内膜组织。因此，我们推测CYP1B1在子宫内膜癌发病机制中起着至关重要的作用。同时CYP1B1在肿瘤中特异性高表达，使用抑制剂对其活性进行抑制，可能成为子宫内膜癌治疗的新靶点。目前研究报道的CYP1B1抑制剂主要有黄酮类化合物、芳烃类化合物、天然香豆素类化合物、天然芪及其类似物［8］。Ware等［9］研究发现，在肿瘤组织中特异性高表达的CYP1B1能介导荧光肿瘤标记物，然后通过显影技术或光动力学疗法对肿瘤进行诊断、治疗和手术定位。

本研究发现随子宫内膜癌手术-病理分期越晚，CYP1B1表达越强，其中晚期表达明显强于早期，提示CYP1Bl可能为判定子宫内膜癌的预后指标。本研究发现随着ER表达逐渐增强，CYP1B1也呈现出表达量逐渐升高趋势。Tsuchiya等［10］研究发现E2调节CYP1B1表达，主要是因为E2可以诱导ER阳性细胞的表达，通过ER对CYP1B1基因发生作用，研究者首次证实了CYP1B1可以被雌激素激活；同时通过染色质免疫和凝胶移位分析显示在CYP1B1基因的启动子区域存在一种雌激素效应元件，ER与这种雌激素效应元件结合后调节E2代谢；利用免疫组织化学法研究CYP1B1与E2的关系提出子宫内膜增生期腺上皮CYP1B1为强表达，染色最深；在分泌期早期为中等强度表达；随着月经周期进入分泌期其表达消失。可见CYP1B1在不同月经周期腺上皮的表达随雌激素水平的变化而变化。CYP1B1与ER在共同参与雌激素代谢方面可能存在密切关系，雌激素水平升高诱导ER产生，激发雌激素效应原件，启动 CYP1B1基因的转录合成CYP1B1蛋白，进而减低雌激素水平。因此，CYP1B1在子宫内膜癌组织中的表达与ER相关。

COMT是在机体各组织中广泛存在的甲基化酶，是具有生物活性和（或）毒性的儿茶酚胺类化合物（如左旋多巴、儿茶酚类固醇、去甲肾上腺素等）的主要代谢酶，COMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基团转移到儿茶酚胺类化合物的3位羟基上，生成可溶于水的代谢产物排出体外，这就避免了DNA的损伤［11］。

本研究结果显示COMT在正常内膜组织表达明显增强，而在癌组织中弱表达或不表达，我们推测COMT对子宫内膜癌发生发展起到保护性作用。同时本研究发现根据术后病理分期p53阴性组的子宫内膜癌组织COMT表达程度高于p53阳性组的子宫内膜癌组织。p53基因是研究最广泛的与人类肿瘤的发生发展密切相关的肿瘤抑制基因之一。在正常组织中不能测出，当细胞DNA损伤发生肿瘤时，p53基因突变聚集，突变失活的p53蛋白导致细胞周期阻滞、诱导凋亡和DNA修复等功能丧失，失去控制细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力而促使肿瘤生长，刺激微血管的增生促进肿瘤的侵袭和转移［12］。

本研究显示，正常内膜组织中，CYP1B1与COMT存在正的直线相关性，即随着CYP1B1表达量逐渐增加，COMT表达有随之升高的趋势。因此，我们推测CYP1B1与COMT在正常子宫内膜中作用协调，保持着雌激素代谢产物的平衡，防止癌症的发生。但内膜癌组织中未发现CYP1B1与COMT存在直线相关关系，二者的失衡在子宫内膜癌的发生中可能占据重要位置。

近年来，CYP1B1和COMT是被关注较多的2种酶，它们在雌激素代谢过程中起到的作用与子宫内膜癌的发生发展及治疗密切相关。本研究所选病例的病理类型均为子宫内膜样腺癌，因此这2种酶是否在子宫内膜癌的其他分型中起着重要作用有待进一步研究。充分了解它们的作用机制可以为子宫内膜癌的靶向性干预和治疗给予明确的指导。（本文图见封二）

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（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSION OF CYTOCHROME P4501B1 IN HUMAN ENDOMETRIAL CANCER AND ITS ASSOCIATION WITH ER EXPRESSION

WANG Jin1，DA Jiping2，XU Peipei1，LI Xuejing1，CHENG Jianxin1，LI Li1*
（1Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospita of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pathology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

ObjectiveTo detect the expression of cytochrome P4501B1（CYP1B1）and catechol-O-methyltransferase（COMT）in endometrial cancer and normal endometrium，and to explore their significance in occurrence and development of endometrial cancer.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of CYP1B1 and COMT in 40 cases of endometrial cancer and 35 cases of normal endometrium.Olympus DP70 imaging system was used to collect image.Image-Pro Plus5.1 image analysis system was applied on the stained specimens for image analysis.ResultsThe expression of CYP1B1 was higher in endometrial cancer tissue than that in normal endometrium（P＜0.05），while the expression of COMT in endometrial cancer tissue was lower than that normal endometrium（P＜0.05）.The expression of CYP1B1 in endometrial cancer became stronger with the increasing of estrogen receptor（ER）expression（P＜0.05）.The expression of CYP1B1 and COMT have positive linear correlation in normal endometrium（r=0.384，P＜0.05）.ConclusionCYP1B1 may play an important role in the occurrence of endometrial cancer depending on ER.COMT plays a protective role in the occurrence and development of endometrial cancer.The two enzymes maintain the normal estrogenmetabolism in the body，and prevent excessive carcinogens production.

endometrial neoplasms；cytochrome P-450 enzyme system；receptors，estrogen

R737.33

A

1007-3205（2012）11-1241-04

2012-04-04；

2012-07-07

河北省科技厅科技支撑计划项目（11276103D-30）

王瑾（1984-），女，河北涿州人，河北医科大学第四医院医学硕士研究生，从事妇科肿瘤诊治研究。

*通讯作者。E-mail：lily_lucky1@yahoo.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.001