Wnt5a、CyclinB2在甲状腺肿瘤组织及血清中的表达及临床意义

王建功，胡万宁*，王晓红，李义慧，刘卫东

（1.河北省唐山市人民医院头颈外科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市人民医院放射化疗科，河北唐山 063000）

Wnt5a、CyclinB2在甲状腺肿瘤组织及血清中的表达及临床意义

王建功1，胡万宁1*，王晓红2，李义慧2，刘卫东2

（1.河北省唐山市人民医院头颈外科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市人民医院放射化疗科，河北唐山 063000）

目的探讨Wnt5a、细胞周期蛋白B2（cell cycle protein B2，CyclinB2）在甲状腺癌患者组织及血清中的表达及其临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应方法检测Wnt5a、CyclinB2在甲状腺癌患者（30例）及甲状腺良性疾病患者（30例）手术切除组织及外周血清中的表达。结果Wnt5a及CyclinB2在甲状腺癌组织及血清中高表达；差异有统计学意义（P＜0.05）。结论Wnt5a、CyclinB2可作为鉴别诊断甲状腺乳头状癌和甲状腺良性病变的重要参考指标，联合检测效果更好，更有实用价值。

甲状腺肿瘤；Wnt蛋白质类；逆转录聚合酶链反应

目前Wnt信号途径与肿瘤的关系，越来越受广大学者的关注。Wnt5a基因是Wnt家族中的重要成员之一。Wnt5a持续表达或过度表达在癌症发生中起着十分重要的作用。Wnt5a基因通过影响肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭与转移过程发挥作用。细胞周期蛋白B2（cell cycle protein B2，CyclinB2）首先在非洲蟾蜍卵中被发现，CyclinB2 mRNA异常表达与肿瘤细胞的增殖有关［1］。由于成年人体内绝大部分细胞，除了原始干细胞、生殖细胞和活化的淋巴细胞外，均不表达CyclinB2，而在部分肿瘤中均可以检测到CyclinB2 mRNA，这一特性使得CyclinB2成为肿瘤细胞的一种理想标志。本实验应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测Wnt5a、CyclinB2在甲状腺癌、甲状腺良性肿瘤组织及血清中的表达，旨在探讨其在甲状腺癌发生发展中的作用，为临床诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集唐山市人民医院头颈肿瘤科2008年1—6月手术切除的甲状腺瘤组织60例，液氮冷冻保存。其中乳头状甲状腺癌组织（A组）30例，男性9例，女性21例，年龄21～69岁，平均46.3岁；甲状腺良性疾病组织（B组）30例（甲状腺瘤15例，结节性甲状腺肿15例），男性11例，女性19例，年龄33～72岁，平均47.4岁。全部组织标本均经3位病理科医师会诊。所有患者均在术前采集了外周静脉血，离心提取血清。

1.2 实验方法：采用Trizol（Biochain Institute，Inc）提取组织及血清中总RNA，NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，随机引物逆转录获取cDNA，cDNA合成后通过荧光定量PCR系统进行PCR反应，同一个标本的目的基因与内参基因（18s RNA）同批扩增，根据扩增产物的 Ct值（cyde threshdd，表示扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数）与其内参量的比值求出各个组织标本所含该基因的相对表达量。应用Primer5.0分别设计基因Wnt5a、CyclinB2及内参18s的引物序列和配套的探针序列，引物及探针序列 如 下， Wnt5a 上 游 引 物， 5′ -ACTGCAGCACTGTGGATAACAC-3′，下游引物，5′-CGCTCACCGCGTATGTGAAG-3′，探针序列，5′-ATGCAGATAGGCAGCCGCGAGA-3′；CyclinB2上游引物，5′-CACAGGATACACAGAGAATG-3′，下游引物，5′-CTTGATGGCGATGAATTTAG-3′，探针序列，5′-ATTGGAAGTCATGCAGCACATGG C-3′，所有 Taqman探针的5′端标记 FAM，3′端标记TAMRA。上述引物和探针均由北京雅康博生物科技有限公司设计合成。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0软件包进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，相关性采用直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

Wnt5a、CyclinB2在甲状腺癌组织、甲状腺良性疾病组织及血清中均有表达，甲状腺癌中的表达明显高于在甲状腺良性疾病中的表达（P＜0.05），见表1，2。

表1 Wnt5a在甲状腺癌和甲状腺良性疾病中的表达比较Table 1 The expression of Wnt5a in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

表1 Wnt5a在甲状腺癌和甲状腺良性疾病中的表达比较Table 1 The expression of Wnt5a in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

*P＜0.05 vs group A by t test

Groups Wnt5a Serum Tissue A 1 547.14±422.69 1 026.68±171.47 B 614.05±52.93* 406.29±119.29*

表2 CyclinB2在甲状腺癌和甲状腺良性疾病中的表达比较Table 2 The expression of CyclinB2 in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

表2 CyclinB2在甲状腺癌和甲状腺良性疾病中的表达比较Table 2 The expression of CyclinB2 in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

*P＜0.05 vs group A by t test

Groups CyclinB2 Serum Tissue A 2 010.01±363.73 1 427.17±546.90 B 740.61±260.47* 707.05±165.43*

以Wnt5a相对表达量＞1 000作为检测甲状腺癌的诊断点，灵敏度为91.6%，特异度为90.0%（χ2=24.75，P＜0.01）。以CyclinB2相对表达量＞1 400作为检测甲状腺癌的诊断点，灵敏度为100%，特异度为93.7%（χ2=52.50，P＜0.01）。

Wnt5a、CyclinB2在甲状腺癌组织中表达呈高度相关性（r=0.967，P＜0.01）。Wnt5a、CyclinB2的表达与性别、年龄、肿瘤直径、临床分期和淋巴结转移等均无关（P＞0.05）。

3 讨 论

近年来出现较多与甲状腺癌发生、发展、转归有关的肿瘤标志物［1］，而理想的肿瘤标志物应该具有特异度和灵敏度高、可信度高、稳定性强的特点。Wnt信号途径的成员有癌基因，也有抑癌基因，它们通过遗传或非遗传途径在人类许多常见恶性肿瘤的发生和发展过程中起着极其重要的作用［2］。目前Wnt信号途径与肿瘤的关系，越来越受广大学者的关注。Wnt5a作为非经典通路的启动基因持续表达或过度表达影响肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭与转移过程发挥作用。Wnt5a基因是Wnt家族中的重要成员之一，定位于染色体的3p14～p21区，Wnt5a起始的631个碱基对包含了很强的启动子活性，该基因编码富含半胱氨酸的生长因子，参与生长和分化过程中的细胞间信号传递［3］。有研究［4］表明在分化的甲状腺癌中，Wnt5a通过对抗经典的Wnt信号途径而发挥抑制肿瘤基因活性。当细胞表面表达Frizzled 4和低密度脂蛋白相关受体相关蛋白5受体时，Wnt5a竟可稳定β-catenin，并活化经典通路中β-catenin下游的靶基因。最终导致细胞阻滞在G2/M期［5］。CyclinB2是细胞周期G2/M期的重要调节因子，目前已经发现CyclinB2在肺癌、乳腺肿瘤发生、发展过程中有重要作用［6-7］。当CyclinB2异常表达时，则失去了对DNA突变监控能力，使细胞过度增殖、分化受阻而发生肿瘤。CyclinB2是CyclinB的一个亚型，在多种肿瘤中都过度表达［8］，与肿瘤某些特异性生物学行为密切相关；CyclinB2 mRNA异常表达与肿瘤细胞的增殖有关。恶性肿瘤细胞通过启动CyclinB2基因的表达促进恶性增殖。本实验结果显示，Wnt5a、CyclinB2在甲状腺良性疾病组织为正常表达，分化型甲状腺癌中的表达明显高于甲状腺良性组织中的表达。提示 Wnt5a及CyclinB2异常表达在甲状腺癌发生中起到重要作用。Wnt5a、CyclinB2可能作为癌基因参与了这一过程，也印证了上述理论的合理性。由此我们认为，甲状腺癌的发生与Wnt5a、CyclinB2的过度表达密切相关，是多种癌基因激活协同作用的结果。

本实验结果表明，Wnt5a及CyclinB2的阳性表达率与甲状腺癌患者性别、细胞分化程度、临床分型及分期无相关性。从而表明Wnt5a及CyclinB2阳性表达可能是甲状腺癌发生的早期分子事件，具有早期诊断价值。此外，由于成年人体内绝大部分细胞，除了原始的干细胞、生殖细胞和活化的淋巴细胞外，均不表达Cyclin B2，而在部分肿瘤中均可以检测到CyclinB2 mRNA，这一特性也使得CyclinB2有望成为肿瘤细胞的一种理想标志。本实验结果提示，Wnt5a、CyclinB2无论是在甲状腺组织还是在外周血血清中，其检测结果与病理结果相吻合。尤其是联合检测Wnt5a、CyclinB2在外周血中的表达具有很好的临床应用前景，可以作为诊断学指标。

［1］TEN YY，ELECTRON K，BRUCE M.Cell surface and secreted protein ofhoman thyroid cancercelllinesrevealdistinct glyloprotein patterns［J］.Proteom Res，2009，8（8）：3958-3968.

［2］YAMAMOTO H，OUE N，SATO A，et al.Wnt5a signaling is involved in the aggressiveness of prostate cancer and expression of metalloproteinase［J］.Oncogene，2010，29（14）：2036-2046.

［3］MCDONALD SL，SILVER A.The opposing roles of Wnt-5a in cancer［J］.Br J Cancer，2009，101（2）：209-214.

［4］WEND P，HOLLAND JD，zIEBOLD U et al.Wnt signaling in stem and cancer stem cells［J］.Semin Cell Dev Biol，2010，21（8）：855-863.

［5］DVORY-SOBOL H，COHEN-NOYMAN E，KAzANOV D，et a1.Celecoxib lea-ds to G2/M arrest by induction of p21 and down-regulation of cyclinBl expression in a p53-independent manner［J］.Eur J Cancer，2006，42（3）：422-426.

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［7］MO ML，CHEN z，LI J，et al.Use of serum circulating CCNB2 in ca-ncer surveillance［J］.Int J Biol Markers，2010，25（4）：236-242.

［8］MEDREK C，LANDBERG G，ANDERSSON，et al.Wnt-5a-CKIα signalingpromotesβ -catenin/E -cadherin complex formation and intercellularadhesion in human breast epithelial cells［J］.J Biol Chem，2009，284（16）：10968-10979.

（本文编辑：赵丽洁）

THE EXPRESSION AND CLINCAL SIGNIFICANCE OF Wnt5a AND CYCLINB2 IN THE THYROID GLAND CANCER TISSUE AND BLOOD SERUM

WANG Jiangong1，HU Wanning1*，WANG Xiaohong2，LI Yihui2，LIU Weidong2
（1.Department of Head and Neck Surgery，the People′s Hospital of Tangshan City，Hebei Province，Tangshan 063000，China；2.Department of Radiotherapy，the People′s Hospital of Tangshan City，Heibei Province，Tangshan 063000，China）

Objective To explore the expression of Wnt5a and CyclinB2 in the thyroid gland cancer and their relationship so as to provide a theoretical basis for the clinical diagnosis and treatment of the disease.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect the expression of Wnt5a and CyclinB2 in 30 cases of papillary thyroid cancer tissue and serum and 30 case of benign thyroid tumor tissue and serum.ResultsWnt5a and CyclinB2 were highly expressed in thyroid cancer tissue and serum with significant differences（P＜0.05）.ConclusionWnt5a and CyclinB2 can be used as important indices for differential diagnosis of thyroid papillay cancer and thyroid benign lesion.The combined detection of Wnt5a and CyclinB2 is better and more valuable.

thyroid neoplasms；Wnt proteins；reverse transcriptase polymerase chain reaction

R736.1

A

1007-3205（2012）11-1268-03

2012-03-31；

2012-05-19

王建功（1975-），男，河北唐山人，河北省唐山市人民医院副主任医师，医学硕士，从事头颈外科疾病诊治研究。

*通讯作者。Email：renmingyiyuanhu@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.011