躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

杨洁

(菏泽医学专科学校,山东 菏泽 274000)

躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

杨洁

(菏泽医学专科学校,山东 菏泽 274000)

目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10.5d Wistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞，将体外培养48 h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上，观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经，术后进行电生理、组织学检测，观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增；将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察，可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面，存活良好，表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性；桥接手术后，电生理检测结果显示，含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组(均P＜0.01)；甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显，再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组（均P＜0.01）。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性，其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞，以此桥接缺损的周围神经，可促进其再生和修复。

躯干神经嵴干细胞；组织工程；壳聚糖纤维；神经再生

周围神经的损伤，再生和功能重建一直是外科领域中的难题之一。多年来临床常规的治疗方法是自体神经移植,但自体神经移植不仅会给供区带来新的创伤，而且常采用的供体—皮神经较细小，不能满足临床需要。绝大多数的周围神经是混合神经，它们含有多种纤维成分，所以当神经损伤后导致损伤近端及远端神经的对位关系紊乱从而影响神经的再生和功能修复[1]。虽然现在的显微外科技术十分发达，但是周围神经损伤的治疗一直没有得到很好的解决。近年来，随着组织工程学的进展为周围神经损伤掀开了新的一页。神经嵴干细胞是一种多潜能神经干细胞，是周围神经系统的原基，也是施万细胞的祖细胞。神经嵴干细胞分为颅和躯干部两种，其中躯干神经嵴干细胞主要分化为周围神经系统的神经元和神经胶质。将躯干神经嵴干细胞作为种子细胞应用于组织工程的研究报道较少。壳聚糖是一种在体内有良好组织相容性、无毒副作用、可自然降解吸收的生物材料，壳聚糖的结构和某些理化性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极其相似，且表面高密度的正电荷有利于黏附带负电荷的细胞，常被应用于组织工程。本实验通过组织植块法体外培养躯干神经嵴干细胞并扩增，将体外培养的躯干神经嵴干细胞的细胞悬液滴加在壳聚糖纤维上共培养；建立大鼠坐骨神经损伤模型，行黏附有躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维—硅胶管桥接大鼠坐骨神经；并对周围神经的再生及再生后神经通路重建的观察。这项实验研究显示了种植有躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维引导轴突再生的可能性，为使用组织工程修复周围神经损伤提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，由山东大学实验动物中心提供；DMEM/F12（1：1）、胎牛血清、MTT、DMSO、多聚赖氨酸（PLL）、5-溴脱氧尿核苷（BrdU）购自Sigma公司；S-100、B27、bFGF购自Gibco公司；小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体购自Boster公司；FITC标记抗兔IgG、TRITC标记抗小鼠IgG、OCT冻存液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；壳聚糖纤维，由上海高纯生物股份有限公司提供，壳聚糖纤维经γ射线消毒后备用；硅胶管购自山东省医学科学院。

1.2 躯干神经嵴干细胞的取材、培养及鉴定 无菌条件下取孕10.5 d大鼠胚胎，解剖显微镜下剖离神经管，切取其躯干部即近尾侧端10个体节长度的神经管。使用0.75 mg/mL胶原酶消化1 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12冲洗组织以抑制胶原酶的活性。将取出的神经管种植于预先用鼠尾胶包被的培养皿中，放入37℃培养箱孵育30 min后，加入5 ml含有10 ng/ml bFGF、10ng/ml EGF培养基。培养48 h后去除神经管。

1.3 神经嵴干细胞种植在壳聚糖纤维上的光镜和电镜观察 原代细胞培养48 h后，在37℃条件下，用0.125%胰蛋白酶溶液消化培养皿中的细胞3 min，10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，吹打后，1000 r/min离心5 min,弃上清液，加入含10 ng/ml bFGF、10 ng/mlEGF的神经嵴干细胞培养液，充分吹打成细胞悬液，将细胞悬液滴加在壳聚糖纤维上培养，隔日加含血清的neuregulin生长因子，培养7d。7d后，在倒置相差显微镜下观察细胞在壳聚糖纤维上的生长、迁徙和分化情况。用含2.5%戊二醛0.1 mol/L的PBS固定2 h，作扫描电镜观察。

1.4 坐骨神经切损及桥接 随机将38只健康雄性Wistar大鼠，分为两组，每组19只。对两组实验动物进行桥接手术：将大鼠腹腔注射水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后固定动物，备皮后，常规进行消毒与铺洞巾，用手指触摸确定大鼠股骨位置后，将实验动物的右腿后部作一个横行正中切口，沿切口处切开皮肤后使用手术剪钝性分离肌肉，充分暴露大鼠右侧的坐骨神经。使用手术剪将其坐骨神经剪断，剪断前用显微针线在损伤坐骨神经外膜挂线，使用显微线缝神经纤维膜向前穿行一段距离，剪断后生成1 cm的缺口。使用黏附有躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维-硅胶管将受损神经的断端缝合，将剪断的神经断端套入硅胶管中结扎，向前平行缝合2针，在受损坐骨神经的另一侧挂线后结扎，然后按顺序缝合肌肉与皮肤，术后动物常规饲养。

1.5 术后观察及检测

1.5.1 动物大体观察 桥接术后，每周定期观察手术部位伤口愈合及大鼠的行走情况。

1.5.2 电生理检测 术后8周及14周，实验组和对照组各随机抽取9只动物，水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉。使用keypoint肌电图仪，将刺激电极置于坐骨结节与大转子之间的坐骨神经表浅部位，记录电极插入小腿三头肌中，地线接于皮肤上，对再生神经进行电刺激诱发再生神经产生动作电位，记录产生动作电位的传导潜速率，测量再生神经的动作电位与振幅，检测两组动物的功能恢复情况。

1.5.3 灌注、取材 大鼠饲养48 h后，水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，经左心室常规灌注。用剪刀沿脊柱两侧剪开皮肤及与之相连的肌肉等软组织，用咬骨钳咬开椎管，小心分离脊髓，取L4－6节段脊髓，置于4%的多聚甲醛PBS溶液中进行后固定，6 h后放入30%的蔗糖PBS溶液中。待脊髓沉到底部，用OCT冻存液包埋，置于-20℃低温冰箱内冷冻12 h，然后转入-80℃超低温冰箱内冻存备用。

1.5.4 冰冻切片及观察 应用恒冷切片机连续横断面切片，片厚20μm，直接贴片法收集切片，封片后直接置于荧光显微镜下观察。

1.5.5 甲苯胺蓝染色、透射电镜观察 术后8周及14周，取再生神经的远端5 mm，2.5%戊二醛固定24 h,磷酸缓冲液冲洗三次，10 min/次；1%锇酸4℃后固定2 h，双蒸水4℃冲洗10 min/次，共三次；梯度乙醇脱水，50%→70%→90%，各10 min，100%两次，各15 min；置换环氧丙烷两次，各15 min；环氧丙烷：树脂＝1：1，1 h，室温；环氧丙烷：树脂＝1：4，1 h，室温；纯树脂浸透2 h，室温；纯树脂包埋，聚合：35℃，16 h；45℃，8 h；55℃，4 h；60℃,48 h；修块，半薄切片，甲苯胺蓝染色，光学显微镜下观察，每个标本取8张切片，对切片使用IPP图像处理系统进行处理，计算实验组和对照组的再生神经纤维密度、直径及再生髓鞘的厚度；超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色。

1.6 统计学处理 通过SAS软件包进行统计分析和处理，实验所得数据用均数±标准差表示，采用t检验对两组间的数据进行比较。

2 结果

2.1 躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上的生长观察

将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维上，培养24 h可见壳聚糖纤维上的细胞多数呈梭形，胞体饱满，立体感强，有2～3个突起，突起首尾相连形成串珠样结构，沿壳聚糖纤维迁徙（图1-A、B）。培养48 h可见有大量细胞黏附。

图1 联合培养24 h后，躯干神经嵴干细胞呈首尾相连黏附在壳聚糖纤维上（←）倒置相差显微镜观察A（×400）B（× 200）

2.2 扫描电镜观察结果 扫描电镜可见壳聚糖纤维上有细胞黏附,细胞呈梭形或椭圆形，胞体较小，末端有两个细长的突起（图2-A）。许多细胞聚集在一起，呈现“端对端”，“肩并肩”的串珠样排列，细胞密集的部位可重叠在一起（图2-B）。

图2 躯干神经嵴分化的施万样细胞在壳聚糖纤维上的生长状态，扫描电镜下观察。

2.3 动物一般观察结果 术后两组动物均行动困难，右后肢拖曳行走，足背触地，少数实验动物切口化脓感染，未经处理自行于两周后结痂；术后14周，两组动物跛行减轻，实验组动物活动度较对照组灵敏。

2.4 电生理检测结果 术后8周，两组动物能记录到微弱的动作电位,波幅较小。术后14周，两组动物均记录到复合肌肉动作电位,两组动物神经传导潜速率及波幅值统计结果显示有显著差异。术后8周再生神经传导潜速率、波幅值比较。单纯硅胶管桥接组神经传导潜速率（10.35±3.27）m/s，波幅值（7.135±1.378）mv；含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维-硅胶管桥接组神经传导潜速率（13.24±3.91）m/s，波幅值（8.819±1.265）mv。(P＜0.01)。

术后14周再生神经传导潜速率、波幅值比较。单纯硅胶管桥接组神经传导潜速率（23.08±4.29）m/s，波幅值（6.035±1.158）mv；含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维-硅胶管桥接组神经传导潜速率（28.50±3.81）m/s，波幅值（9.699±1.325）mv(P＜0.01)。

2.5 甲苯胺蓝染色及透射电镜观察结果 术后8周甲苯胺蓝染色显示，两组实验动物再生轴突的髓鞘化不太明显，有髓纤维数目较少；术后14周甲苯胺蓝染色显示，单纯硅胶管桥接组有髓纤维数目较少，分布不均匀；含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组桥接组再生轴突的髓鞘化更明显，有髓纤维数目较多，排列紧密。

3 讨论

在临床上外伤，肿瘤等常常导致周围神经损伤，导致患者致残，丧失劳动和生活能力，如何修复受损的周围神经一直困扰着专家学者。在早期的研究中，人们常常使用自体神经移植进行周围神经缺损的修复治疗，但是自体神经并不能很好的解决神经缺损带来的不良后果，比如神经再生后的功能重建问题等，而且自体神经的来源和取材较为困难[2-3]。所以使用组织工程的方法构建具有种子细胞活性的组织工程化人工神经，以促进周围神经损伤的修复成为近年来研究的热点。

组织工程学是一门利用组织学与工程学的方法研究生物可替代物的科学。这种生物可替代物包括细胞、器官与组织。组织工程器官包括骨、皮肤、血管及输尿管等。组织工程化人工神经的关键因素是种子细胞的培养与扩增、支架材料的选择以及神经生长的微环境。Fansa等[4]最先将体外培养的施万细胞植入经过去除细胞成分的骨骼肌后，桥接于坐骨神经的损伤处，促进了损伤神经的再生。在病理生理过程中，施万细胞参与周围神经的修复首先是形成Büngner条带[5-8]，从而引导轴突延伸。实验证明单纯移植施万细胞虽对神经再生有效。国内很多学者利用施万细胞结合相关生物材料修复周围神经离断损伤取得了满意的实验效果[9]。

施万细胞作为一种神经胶质细胞可以在周围神经损伤后可分泌营养因子，这种营养因子对神经的再生和修复起诱导及营养的作用。有研究显示：在周围神经的损伤时施万细胞起了调控再生神经生长的作用。但是施万细胞作为一种终末期的细胞，其数量及分化能力是非常有限的。

近年来，国外学者对神经嵴干细胞进行了研究，发现神经嵴干细胞在体内、外均可以分化成为施万样细胞，为周围神经损伤后的再生提供有利的微环境[9]，这为筛选构建组织工程化人工神经的种子细胞提供了新思路。

神经嵴是在胚胎发育早期，外胚层与神经沟边缘之间的神经外胚层细胞在神经管的背外侧构成与神经管平行排列的两条带状的细胞索，从中脑平面一直延伸至尾部。根据其位置，又可分为颅神经嵴和躯干神经嵴两部分。由神经嵴分化出的细胞称为神经嵴干细胞。神经嵴干细胞主要分化成为脊髓和脑的感觉神经节细胞和内脏神经节后神经元以及神经膜细胞、卫星细胞、施万细胞等周围神经胶质细胞，并可分化成为滤泡旁细胞、颈动脉体Ⅰ型细胞、黑色素细胞、肾上腺髓质的嗜铬细胞等[10-11]。本实验将体外培养的躯干神经嵴干细胞吹打成细胞悬液种植于壳聚糖纤维上，共培养24 h后使用倒置相差显微镜观察，可见壳聚糖纤维上的细胞多数呈梭形，有2～3个突起，胞体饱满，立体感强，沿壳聚糖纤维迁徙。培养48 h后可见有大量细胞黏附于壳聚糖纤维上。扫描电镜观察，可见壳聚糖纤维上有大量的细胞黏附，细胞大部分呈梭形，胞体较小，末端有两个细长的突起，细胞密集的部位可重叠在一起，部分细胞末端呈扁平样膨大，并伸出爪形伪足紧紧贴附于纤维的表面，胞体表面可见颗粒状隆起和绒毛样突起。以上实验充分说明了体外扩增培养的躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维的生物相相容性良好。

虽然壳聚糖在组织工程中有许多的优势，但是单纯使用壳聚糖纤维作为支架材料并不理想。原因是壳聚糖的硬度低，易塌陷，作为支架材料必须具有抵抗外部组织的挤压，同时为再生神经向远处生长提供较为宽阔的空间。为了达到这一目的，我们使用壳聚糖纤维复合硅胶管的方法制成桥接管。硅胶管的硬度及韧性良好，我们事先将硅胶管剪成1cm的小管，沿其纵轴剪开后内腔平铺种植有躯干神经嵴干细胞的壳聚糖纤维，利用硅胶管的韧性回缩力使其自然卷缩成管状。实验证明硅胶管为损伤的坐骨神经的修复提供了空间，利用其硬度可以保护再生神经免于受到周围组织的压迫，但是作为支架材料，硅胶管的可降解性差，在应用时还需二次手术，这一问题在以后的研究中需要进一步的探讨。

神经传导潜速率代表了神经冲动在神经干、神经肌肉接头上的传导速率，所以可更好地表示运动神经纤维再生后与肌肉重建的联系及其功能恢复情况，而且此方法操作简便，对神经的刺激较少，并可重复实验[12]。所以我们在观察再生神经功能恢复时，采用肌电图测定神经传导潜速率的方法。术后8、14周肌电图检测结果显示实验组再生神经的运动传导潜速率及波幅值均明显好于对照组，说明含实验组再生神经的运动传导功能恢复要好于使用对照组。

术后8周，取桥接区再生神经超薄切片透射电镜观察，实验组动物的再生神经髓鞘数量多于对照组；但半薄切片甲苯胺蓝染色显示实验组和对照组再生神经纤维的髓鞘不明显；术后14周取桥接区再生神经超薄切片透射电镜观察，实验组动物的再生神经显微髓鞘数量要明显多于对照组，再生的神经纤维髓鞘较厚；半薄切片甲苯胺蓝染色显示实验组再生的神经纤维的数量和排列均优于对照组。

本实验研究结果表明，躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维具有良好的组织相容性，躯干神经嵴干细胞不仅黏附于壳聚糖纤维上生长，还可以分化成为施万样细胞。我们将神经嵴干细胞作为种子细胞种植于壳聚糖纤维上，并与硅胶管一起制作成组织工程桥接管，为周围神经提供了一个有利的再生微环境，实验证明其能促进周围神经修复，具有很好的应用前景和深入研究的价值

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An Empirical Study on Repairing the Injury of Sciatic Nerve with the Trunk Neural Creat Stem Cell and Chitosan Fiber to Compound the Slilica Gel-tube

Yang jie
(heze Medical College,heze,shandong,274000)

Neural crest；Stem cell;tissue engineering;chitosan;nerve regeneration

R616;R651.2

A

1008-4118（2012）01-0001-05

10.3969/j.issn.1008-4118.2012.01.01

2011-12-23

菏泽医学专科学校基金研究课题（编号：H11K01）。

Absrract：ObjectiveWe isolate and culture the trunk neural crest stem cell using tissue culture of neural tube in the E10.5 Wistar rat embryo in defined medium,then explore its’biological properties.MethodsThe trunk neural crest stem cells using tissure culture of neural tube in vitro were cultured on the chitosan fiber.Used immunofluoresecence to indentify the trunk neural crest cells.Observed the histocompatibility of them,the trunk neural stem cells were cultured with the chitosan-slilca sebific duct scaffold, the growth of cells was observed by scanning electron microscope.10mm sciatic nerve defects were bridged with chitosan-slilca sebific duct scaffold cultured with trunk neural stem cells,sebific gel tubes without trunk neural stem cells served as controls.After grafting, the regenerated nerves were evaluated by electrophysiological examination,histological staining,retrograde tracing and electron microscope observe.ResultsUsing tissure culture of neural tube,we can isolate and culture the trunk neural crest stem cells.The trunk neural crest stem can grow adhered on the chitosan fiber after inoculation.Scanning elector microscope,the trunk neural crest stem cell were spindle.proliferated and migrated along fiber.There is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neural crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell..At 8 weeks after surgery,weak action potentials were found in the experiment group only.At 14 weeks after surgery,the conduction velocity and wave amplitude of experiment group was better than the control group,and the difference was evident（P＜0.01）.ConclusionThere is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neural crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell.They contributed to the promotion of axonal regeneration.