西藏当雄县无浆体分子流行病学调查

孙彩琴，刘建枝，黄 磊，罗布顿珠，汪月凤，刘志杰，罗建勋，殷 宏＊

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；3.西藏大学农牧学院，西藏林芝 860000）

无浆体病（Anaplasmosis）（旧称边虫病）是经蜱传播的细胞内专性寄生的一类立克次体目无浆体科无浆体属的无浆体引起的疾病［1］。该病多发于牛、羊、鹿等反刍动物，菌体寄生于宿主红细胞内。病程常呈慢性经过，临床症状为高热、贫血、黄疸和渐进性消瘦，急性发病时可导致动物死亡［2］。目前研究最多的动物无浆体有3种，即边缘无浆体（A.marginale）、中央无浆体 （A.centrale）和羊无浆体（A.ovis）。硬蜱是羊无浆体的主要传播媒介。我国西北广大养羊区羊无浆体的媒介蜱有3种，它们分别为分布在甘肃和宁夏的草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、内蒙古西部地区的亚东璃眼蜱（Hyalommaasiaticum）和短小扇头蜱 （Rhipicephaluspurmilio），并证明这3种蜱对羊无浆体的传播方式都是间歇性吸血传播。

无浆体的常规诊断主要是根据流行史、临床症状、尸体剖检和血涂片检查等进行综合诊断。但常规检测难以发现早期感染，亦不利于大规模的流行病学调查，分子生物学诊断方法可弥补常规检测方法的不足。分子生物学诊断方法主要有核酸探针检测法、反向线状印迹杂交技术（RLB）［3］和聚合酶链式反应（PCR）。PCR技术已被用在大多数无浆体病原的检测上，由于边缘无浆体、中央无浆体和羊无浆体的MSP5基因和MSP2基因之间的同源性较高，已成为属特异性PCR检测的主要目标基因。另外，主要抗原蛋白1（MAP1）和16SrRNA基因也是常用的靶基因。16SrRNA基因是目前常用于细菌分类鉴定的基因之一，尤其适用于不能培养的病原菌的分类鉴定，该基因在无浆体病原分类鉴别上已经有了广泛的应用。

无浆体病多发于夏秋季，与媒介蜱的活动季节相一致，在3月～6月出现，8月～10月达高峰，11月尚有个别病例。银盾革蜱（DermacentorniveusNeumann，1987）与西藏革蜱（D.everesitianusHirst，1926）是我国西部省区常见的蜱种。它们都是高原蜱种，2月到6月是其活动高峰期，D.niveus分布于陕西、青海、甘肃、新疆和西藏，D.everesitianus分布于高原灌丛草原，多在海拔4 000m以上。当雄（藏语意为“挑选的草场”），位于西藏自治区中部，可利用草场面积70万hm2，该县是个牧业生产县，其中绵羊22.46万只，占家畜存栏总数的42.55%。无浆体病的分布对当地的养羊业构成了潜在的威胁。本研究采用无浆体属特异性引物从蜱的全基因组中扩增16SrRNA基因的部分片段，对西藏当雄地区蜱无浆体感染率及种类进行分子流行病学调查和遗传进化分析，为该地无浆体病的诊断和防控提供流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2011年5月份从西藏当雄县三个地区即当雄县城地区、乌玛乡和龙仁乡的绵羊身上采集未叮咬的成蜱样品。样品保存在750mL／L的乙醇中，带回实验室后由专业人员根据形态学对蜱进行种类和性别鉴定。

1.1.2 主要仪器和试剂 基因组提取试剂盒：QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）；PCR 仪：My cycler thermal cycler （BIORAD），DNA Engine peltier Thermal Cycler（BIORAD）；DYY－Ⅱ型电泳仪，北京六一仪器厂生产；JS－680B全自动凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司生产；DNA凝胶回收试剂盒，LATaqDNA聚合酶和 dNTP，10×PCR buffer，克隆载体pGEM－T Easy，大肠埃希菌JM109，均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 引物 EE1／EE2［3］可扩增无浆体16SrRNA基因，具有无浆体属特异性，预扩增的目的片段长度为1 430bp，由宝生物工程（大连）有限公司合成，序列如下：EE1：5′－TCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC－3′；EE2：5′－AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG－3′。

1.2.2 样品DNA提取及PCR扩增 样品DNA的提取方法参照QIAamp DNA Mini Kit说明书进行。首先用双蒸水润洗10min，置于吸水纸上，晾干后放入1.5mL的Eppendorf管中（每管1只）；每管中加入50μL PBS（pH7.2）缓冲溶液，利用消毒好的剪刀和镊子将其尽量剪碎；各管中加入180μL ATL溶液，20μL蛋白酶K，涡旋混匀，置于56℃加热器中3h使得组织充分裂解；短暂离心后，加入200μL AL溶液，脉冲式涡旋15s，70℃孵育10min；短暂离心后，加入200μL无水乙醇，同上进行涡旋；将QIAamp层析柱安装到2mL收集管中，把上一步骤中得到的混合物转入层析柱中，静置1min后，8 000 r／min离心1min；弃去收集管，将层析柱安装在新的收集管上，加入500μL AW1溶液，8 000r／min离心1min；换上新的收集管后，加入500μL AW2溶液，14 000r／min离心3min；再高速空离1min，将层析柱安装在1.5mL Eppendorf管上，加入50 μL AE溶液，室温孵育5min，8 000r／min离心1 min。随机挑选提取的基因组，用Nanodrop 2000紫外分光光度计对其纯度和浓度进行测定，基因组DNA样品置－20℃保存备用。

引物合成后用灭菌双蒸水将其稀释成10 μmol／L，PCR反应体系为25μL。在PCR反应管中加入以下成分：LATaq酶0.25μL；10×LA PCR buffer 2.5μL，dNTP 4μL，EE1 1μL，EE2 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 15.25μL。每组反应设阴性对照，以蒸馏水代替基因组DNA。PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，12℃结束反应。扩增产物通过10g／L琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

1.2.3 PCR产物连接、克隆及鉴定 PCR阳性产物，利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带，而后进行连接。连接反应体系为10μL，包括纯化的产物3μL，pGEM－T Easy载体1μL，连接酶buffer 5μL，T4DNA连接酶1μL，充分混匀后16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化进大肠埃希菌JM109感受态细胞，加入IPTG（100 mmol／L）4μL，X－gal（20mg／mL）16μL，混匀后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养16h～18h。从平板上挑取单个白色菌落接种于4 mL LB培养液，37℃振荡培养6h。PCR检测为阳性的菌液样品送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。应用DNA Star分子生物学软件处理获得的序列，并在 http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi网站上进行比对分析。

1.2.4 相似性比较及系统进化分析 从NCBI中下载相关物种的16SrRNA基因序列，将犬埃里克体（Ehrlichiacanis）（EF011111）作为外群，选择羊无浆体3株，分别是A.ovisisolate Yuzhong［AJ633050］，A.ovisisolate Jingtai［AJ633049］和A.ovisisolate OVI from South Africa［AF414870］；边缘无浆体4株，分别是A.marginalestrain Veld［AF414873］，A.marginalestrain Florida［AF309867］，A.marginalestrain St.Maries［AY048816］和A.marginalestrain South Idaho［AF309868］；中央无浆体2株，分别为A.centralestrain vaccine from Australia［AF414868］和A.centralestrain Israel vaccine［AF309869］；另外还有A.bovisisolate R7［JN558828］，A.phagocytophilumclone J4－3－6［AY969014］和本研究中测序获得的2个克隆，A.ovisisolate XG34和LYG106，共14条序列。采用Mega Align 4.0数据软件处理序列，用邻近法（NJ）构建16SrRNA基因系统进化树，并进行多序列的同源性比较。

2 结果

2.1 各地区蜱的分类及无浆体16SrRNA基因扩增结果

采集的511份饥饿成蜱，经形态学鉴定为2个种，即西藏革蜱（D.everestianus）和银盾革蜱（D.niveus）。以提取的蜱基因组DNA为模板，采用无浆体属16SrRNA基因特异性引物对EE1／EE2进行PCR扩增，结果在1 400bp附近扩增出一条特异性的条带，与预测的目的片段大小一致（图1）。这批样品中，共检出阳性样品34份，总体感染率为6.7%（34／511）（表1）。将部分阳性样品中的目的片段进行回收、连接和克隆，将菌液PCR鉴定为阳性的菌液送出测序，得知扩增产物为1 430bp，BLAST结果显示与羊无浆体同源性较高。

2.2 16SrRNA基因序列同源性比较及系统发育分析结果

通过PCR方法共检出阳性样品34份，但由于其中3个样品扩增出来的目的产物含量较低，导致连接失败，最终只获得31条序列。将这些序列进行比对后，发现同源性范围为99.6%～100%。提示我们检测到的无浆体是单一种，在NCBI中BLAST分析后，证实与羊无浆体关系最近。

图1 16SrRNA基因片段的PCR扩增结果Fig.1 PCR results of the 16SrRNA gene from field samples and control

表1 西藏蜱样中羊无浆体的感染率情况Table 1 The infection rate of A.ovis in ticks collected from Tibet

再将本试验测序获得的2个克隆序列XG34和LYG106的16SrRNA基因序列与GenBank收录的A.ovis［AJ633050、AJ633049和 AF414870］，A.marginalestrain Veld［AF414873、AF309867、AY048816和AF309868］，A.centrale［AF414868］和A.centrale［AF309869］，另外还有A.bovis［JN558828］，A.phagocytophilum［AY969014］等序列进行同源性分析，显示本试验获得的克隆与A.ovis同 源 性 最 高，为 99.7% ～99.8%；与A.marginale和A.centrale的同源性为99.1%～99.4%；与A.bovis和A.phagocytophilum同源性为95.9%、96.2%。

用上述14条16SrRNA基因序列构建进化树，结果显示XG34和LYG106分离株的16S rRNA基因序列与A.ovis（AJ633049、AJ633050和AF414870）位于同一分支上。A.marginale、A.centrale、A.bovis和A.phagocytophilum分别位于不同的分支上（图2）。以上数据一致表明，本研究中检测到的病原是羊无浆体。

3 讨论

无浆体病是一类重要的自然疫源性疫病。主要病原有嗜吞噬粒细胞无浆体（A.phagocytophilum）、边缘无浆体、中央无浆体、牛无浆体（A.bovis）和 羊无浆体。该病病原的传播媒介为硬蜱，研究已证实微小牛蜱（Boophilusmicroplus）、亚东璃眼蜱 （Hyalommaasiaticum）、篦子硬蜱 （Ixodes ricirus）和有纹革蜱 （Dermacentorpictus）可传播边缘无浆体，草原革蜱 （D.nuttalli）、银盾革蜱（D.niveus）、亚东璃眼蜱 （H.asiaticum）和短小扇头蜱 （Rhipicephaluspurmilio）可传播羊无浆体［4］，长角血蜱 （Haemaphysalislongicornis）和巨棘血蜱（H.megaspinosa）可传播牛无浆体［5－7］，全沟硬蜱（Ixodespersulcatus）可传播嗜吞噬细胞无浆体［8］。羊无浆体广泛分布于世界各地，尽管致病性不是很强，但会影响养羊业的可持续发展。本研究应用常规PCR方法对西藏当雄地区的蜱样进行了检测，发现呈单一无浆体，即羊无浆体感染，感染率为6.7%。西藏革蜱和银盾革蜱的感染率分别为6.1%和6.7%，不同蜱种的感染率差异不显著。从西藏革蜱和银盾革蜱的基因组中分别扩增到了羊无浆体16SrRNA基因，证明这两种蜱是该地区羊无浆体病的潜在传播媒介。对不同地区蜱感染无浆体结果分析显示，不同地区感染率有较大区别，其中乌玛乡最高，为20.6%（14／68），当雄县城地区与龙仁乡样品的阳性率较低，分别为5.7%（5／88）和4.2%（15／355）。已知羊无浆体对山羊和绵羊危害较为严重，而当雄县局部地区蜱绵羊无浆体感染率较高应引起当地兽医工作者的重视。

图2 利用16SrRNA基因序列构建的无浆体系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Anaplasmaspecies constructed using partial 16SrRNA sequences

无浆体传统的检测方法有镜检和体外培养，但体外培养不易进行，尽管近年来边缘无浆体的体外培养取得了一定的进展，但至今尚未有羊无浆体体外培养的报道。镜检虽然比较省时省力，易于操作，但对于一些泰勒虫和巴贝斯虫混合感染病例，镜检较难有效地对病原进行区分。由于缺乏体外培养系统，缺乏合适的实验动物模型，也较难用显微镜镜检地方法准确的区分病原，把16SrRNA基因引入到了羊无浆体的分类学研究之中能较好的弥补传统分类学的缺陷。有研究以16SrRNA基因序列合成通用引物，对边缘无浆体进行了扩增，并提出了用这种方法对边缘无浆体系统发生关系研究的可能性，为无浆体病的分子分类学研究提供了依据。本试验就是基于这种方法，扩增出了大小为1 430bp的特异性片段，将测序获得的2个克隆XG34和LYG106的16SrRNA基因序列作为代表序列与国内外报道的11株菌株的16SrRNA基因序列进行同源性及系统进化分析。从进化树上看出，从西藏地区检测到的羊无浆体与国内报道的2株羊无浆体和南非分离到的A.ovisisolate OVI分到了一个大的分支上，并且可区分边缘无浆体和中央无浆体，这些结果不但再次证明了该分类标准的应用价值和意义，也证明了16SrRNA在无浆体种内的高度保守性。这与周作勇［2］获得的结果一致。

该病呈世界性流行，已报道的国家有伊朗、叙利亚、伊拉克、哈萨克斯坦、土库曼、乌兹别克斯坦和美国等。在我国新疆和布克塞耳蒙古自治县也发现有绵羊无浆体病。应用补体结合试验和病原检测相结合的方法对甘肃绵羊无浆体病的分布进行了调查，在陕西、甘肃、宁夏和青海四省（区）23个县的绵羊和山羊中发现绵羊无浆体病。近年来河南、山东、四川和广东发现有该病，给疫区的养羊业造成了威胁［9－11］。本研究丰富了我国绵羊无浆体病的流行病学资料，提示西藏地区也有此病的分布。但本次采样地点集中在当雄县，不能代表整个西藏地区，在西藏地区开展更大规模的流行病学调查是在该地区开展本病研究的当务之急。

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