骨伤宁软膏中红花药材的提取工艺研究

杨文娟，牛 阳，王 荣，毛跟年

（1.陕西科技大学，陕西西安 710021；2.宁夏医科大学，宁夏银川 750004）

骨伤宁软膏是宁夏吴忠回医正骨医院临床用于治疗骨折中后期的有效制剂，能够改善骨折部位的生物力学性能，对骨痂内骨胶原的积累和钙盐沉积有促进作用，改善蛋白代谢，促进蛋白质多糖合成及钙化，加速骨痂的形成和骨折愈合的时间。不仅保证了骨折愈合，促进骨痂生长，还能防止骨不连发生［1］。骨伤宁软膏中含有红花、海螵蛸、自然铜等药材，其中红花药材用药量大，具有活血散淤、消肿止痛的作用，本文采用正交实验法，以紫外分光光度法测定红花提取液中羟基红花黄色素A（HSYA）的含量，同时考虑到骨伤宁软膏在制剂成型中对原料产量的要求，故将提取工艺的干膏率也作为该工艺的评价指标之一，对这两项指标综合评价，以优选提取骨伤宁软膏中红花药材的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 红花产地新疆，购于西安鹿鸣中药饮片厂，为菊科植物红花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花。方中海螵蛸、自然铜等药材经鉴定均为正品药材。HSYA 对照品（批号111637－200803），由中国药品生物制品检定所供应。

1.1.2 仪器 754PC型紫外－可见分光光度计为上海菁华科技仪器有限公司产品，FA1004N电子分析天平为上海精科天平仪器厂产品，DHG－9123A台式鼓风干燥器为上海精宏试验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HSYA含量测定

1.2.1.1 检测波长的确定 分别配制HSYA对照品以及骨伤宁软膏各药材水提取液，在200nm～500nm范围内进行扫描，以HSYA及水提取液的最大吸收波长作为检测波长。

1.2.1.2 HSYA标准曲线确定 精密称取HSYA对照品0.001 2g，蒸馏水溶解后转移至10mL量瓶中，制成储备液。分别量取储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL对照品溶液于10mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为2.4、4.8、7.2、9.6、12.0、14.4μg／mL的标准品溶液，在最大吸收波长处测定吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.1.3 方法学考察 为了保证HSYA含量测定方法的可靠性，对该含量测定方法进行精密度、重现性、稳定性、加样回收率等方法学考察。精密度试验取同一份HSYA对照品溶液连续测定5次，计算相对标准偏差（RSD）；重现性试验取同一份水提液连续测定5次，计算RSD；稳定性试验取同一份HSYA对照品溶液在15、30、45、60、75、90min测定，计算RSD；加样回收率试验取已知浓度的同一水提取液6份，分别加入相当于已知浓度60%、80%、100%的HSYA对照品溶液各2份，计算回收率。

1.2.2 水提浸膏的制备 称量按处方比例混合的海螵蛸、自然铜等药材1.8g，用10倍量水在常温下浸泡30min，然后按处方量加入红花药材，按照表1安排的正交实验条件，加入一定倍量水，在一定温度下温浸一定时间，抽滤，滤液留用。药渣按同样条件处理，抽滤，合并2次滤液。取少量滤液按照1.2.1项下方法测定HSYA含量。将合并后滤液转移至干燥恒重蒸发皿中，于水浴蒸发至干，105℃干燥3 h，移至干燥器中，冷却30min，迅速精密称重，计算干膏率。以HSYA含量和干膏率为综合评价指标，权重系数均为0.5。

1.2.3 提取工艺的正交实验设计 根据预试验和文献报道［2－5］，选取加水倍量、提取温度、提取时间等3个影响因素，每个因素选3个水平，按表1设计L9正交试验。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 提取工艺的验证试验 根据正交试验结果得到骨伤宁软膏的水提取工艺，为了保证该工艺的重现性，对该工艺进行3次验证试验。

2 结果

2.1 检测波长的确定

以蒸馏水为参比液，对HSYA对照品溶液以及水提取液在200nm～500nm范围内进行扫描，得到最大吸收波长均在404nm处，因此，采用404nm为骨伤宁软膏红花药材提取工艺中HSYA含量测定的检测波长。

2.2 HSYA标准曲线

以浓度（C）对吸光度（OD）做标准曲线，并进行线性回归分析，结果表明，HSYA对照品溶液在浓度与吸光度之间呈现良好的线性关系，经回归处理得方程：C＝45.56OD－0.004 2，R2＝0.999 7（图1）。

2.3 方法学考察结果

精密度试验结果显示，连续测定同一HSYA对照品溶液5次，RSD为0.61%，方法精密度良好；重现性试验结果显示，连续测定同一份水提液5次，RSD为0.83%；稳定性试验结果显示，每隔15min测定HSYA对照品溶液吸光度，RSD为0.86%，表明HSYA对照品溶液在90min内稳定性良好；加样回收率试验结果显示，6次试验的平均回收率为99.5%。

图1 HSYA标准曲线和回归方程Fig.1 Standard curve and regression equation of HSYA

2.4 提取工艺正交试验结果

按照1.2.2中水提浸膏的方法及表1的因素水平进行正交试验，结果见表2。由表2中极差R值可知，影响因素主次为A＞B＞C，表3的方差分析结果表明，影响因素主次为A＞B＞C，即提取温度是影响HSYA提取率的主要因素，这与HSYA对热不稳定，遇热易分解的性质相符［6－8］，最佳提取工艺为A1B3C3。由正交试验的9次试验结果可知，方案3（A1B3C3）的综合指标分数最高，这与直观分析和方差分析后的结果一致。

表2 正交试验结果Table 2Results of orthogonal test

2.5 提取工艺验证试验结果

对正交试验结果优选的最佳提取工艺A1B3C3进行3次验证试验，结果见表4。结果表明，试验重现性好，工艺稳定，HSYA含量较高，且干膏率也符合骨伤宁软膏制备所需的原料要求，故最佳提取工艺为A1B3C3，即加水15倍量，在70℃下温浸90 min，提取2次。

表3 方差分析结果Table 3Results of variance analysis

表4 验证试验结果Table 4Results of verifying test

3 讨论

骨伤宁软膏为回药治疗骨伤的传统方，具有续破折，止血收敛，止痛，生肌的功效，临床主治筋肉断裂、创伤不愈、血流不止等病症。骨折愈合的过程就是“淤去、新生、骨合”的过程，对“折伤”的论治，历代医家强调了活血、益气，补肾几方面，强调活血化淤在骨折损伤治疗中的重要性［9］。方中包括红花、自然铜、海螵蛸等具有活血化淤、祛风利湿、止痛功效药材。海螵蛸、自然铜等为矿石、骨甲类药材，按照中药煎煮原则，属于先煎药材，有效成分用水冷浸后再进行热水提取。红花为植物的花，质地较轻，按照中药煎煮原则，属于后下药材，先冷浸一定时间再进行提取。其中红花药材用量最大，HSYA为活血化瘀的主要活性成分［10－11］，在水中的稳定性要优于在乙醇中［12］，且对热不稳定，故选择热水温浸法进行提取。考虑到对温度敏感，因此在试验中设置了对提取温度的考察，结果表明，提取温度是影响HSYA提取的关键因素。此外，考虑到药材提取物得率是影响制剂制备原料的重要因素，因此，将干膏率与HSYA含量综合评分。由正交试验数据分析可知，最佳组合A1B3C3与正交试验方案3的组合一致。通过对该最佳工艺进行验证试验的结果可以看出，工艺A1B3C3的干膏率和HSYA含量稳定，重现性好，工艺可操作性好。故选择A1B3C3为骨伤宁软膏红花药材提取工艺的最优组合方案。

［1］马英锋，张金军，牛 阳，等.回药张氏正骨膏治疗骨不连60例疗效观察［J］.宁夏医科大学学报，2009，31（1）：125.

［2］初 阳，宋洪涛，陈大为，等.红花黄色素提取工艺的研究［J］.中草药，2006，37（8）：1161－1164.

［3］刘庆华，陈孝娟，于 萍，等.红花红色素的提取工艺研究［J］.新疆医学，2011，41（3）：133－136.

［4］朱文明，潘 见，金日生，等.正交试验法优选红花中红花黄色素提取工艺［J］.安徽大学学报：自然科学版，2008，32（1）：85－89.

［5］于红艳，董玉秀.红花提取工艺的正交实验研究［J］.河南中医学院学报，2008，11（6）：35－36.

［6］孙婷婷，蒋丽芳，裴正玲，等.影响红花红色素稳定性的因子研究［J］.微量元素与健康研究，2011，28（1）：38－40.

［7］王 慧，张立伟，晋民杰，等.羟基红花黄色素A稳定性研究［J］.太原科技大学学报，2010，31（1）：81－84.

［8］金 鸣，臧宝霞，李金荣，等.羟基红花黄色素热稳定性的初步研究［J］.中国中药杂志，2003，28（12）：1197－1198.

［9］张永斌，王 萧，郭学军，等.壮筋补骨丸促进新西兰兔骨折愈合的 X线影像学比较研究［J］.动物医学进展，2007，28（2）：37－41.

［10］Matsuba S，Yamada N，Yamazaki T.Antioxidative activity of safflor components in rats［J］.J Japan Soci Nutri Food Sci，2003，56：365－369.

［11］Kanehim T，Homma T，Saito K.On restricting activity of cartham in and safflor yellow B against superoxid anion formation in an experimental model system［J］.Romanian Biotech Lett，2001，5（5）：361－364.

［12］李秀梅，黄罗生，富志军.光照条件对红花黄色素稳定性的影响［J］.海峡药学，2011，23（5）：64－66.