浦东地区部分养猪场常见病原菌的分离与鉴定

俞向前，贾 锐，刘耀方，顾武军，龚大弟，范德忠，朱建国，叶承荣＊

（1.上海市浦东新区动物疫病预防控制中心，上海 201299；2.上海交通大学，上海 200240；3.上海市浦东新区农业服务中心，上海 201201）

近年来，随着浦东新区养殖业格局的调整，规模化、集约化养猪场疫病流行出现了一些新的变化。某些地区的规模猪场一定程度地存在着猪只发育迟缓、体弱、发病乃至死亡，直接导致较高的死淘率。这些发育迟缓、体弱和发病的猪只，不但影响猪场正常生产，而且增加了养殖成本，严重困扰着当地养猪业的健康发展，也给食品卫生和人的健康造成隐患。当地技术部门通过长期系统的调查研究后认为，造成死淘率偏高的原因是多方面的，其中以疫病流行为主要原因，因此，采取包括猪群疫病防控技术在内的、旨在降低生猪死淘率的综合技术体系，是今后一段时间内我国养猪业面临的紧迫课题之一。

本研究针对浦东地区重点猪场主要疫病发病特点，对一些重要致病菌如沙门菌、巴氏杆菌、链球菌等本地带菌状况进行调查分析，以期获得猪场疫病流行病学数据，制定合理的防治方案。

1 材料与方法

1.1 材料

TaqDNA聚合酶、DNA Marker、pMD－18－T载体和DNA凝胶回收试剂盒，PCR Mix试剂、E.coliDH5α、氨苄青霉素（Amp），宝生物工程（大连）有限公司产品；生化反应试剂盒，北京陆桥技术有限责任公司产品；培养及原料琼脂、蛋白胨、酵母膏，宝生物工程（大连）有限公司产品；TSA （Tryptic soy agar）、麦康凯（MC ）琼脂、THB肉汤（Todd He－witt）以及50mL／L绵羊血琼脂平板，上海凌峰化学试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 考虑到目前养猪场普遍存在多种病原菌混合感染的情况，本试验选择养猪场常见的沙门菌、多杀性巴氏杆菌以及链球菌为重点分离目标菌。对现场剖检病猪无菌采集猪只肺脏、肝脏、心血、大脑、关节液、肠管、脾脏和淋巴结等作为接种病料，分别选择3种病原菌的培养基当场直接划线，送实验室进行培养。针对沙门菌疑似病料，参照文献［1］的方法，将病料接种于营养琼脂平板上，置于37℃培养24h，然后从平板上挑取单个可疑菌落接种于麦康凯琼脂平板上，于37℃培养24h，对可疑菌落进行涂片，革兰染色后镜检；针对多杀性巴氏杆菌，按照文献［2］的方法，将病料接种于TSA培养基，置于37C培养过夜，挑取可疑菌落进行瑞染色镜检；对于链球菌，按照文献［3］的方法，将病料接种到BHI 5mL培养基中，进行选择性增菌培养，再划线接种到50mL／L绵羊血琼脂平板上，37℃培养24h，对可疑菌落进行涂片，革兰染色后镜检。将这些初步确定属性的菌落进一步用生化实验进行鉴定。

1.2.2 生化鉴定 用分离的疑似菌纯培养物进行各种微量生化鉴定管的接种培养，结果的判定及实验操作过程严格按照说明书的说明。

1.2.3 菌落的PCR鉴定

1.2.3.1 PCR引物的设计与合成 沙门菌，根据参考文献中报道的组氨酸转运操纵子基因设计引物［4］：上游：5′－ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG－3′；下游：5′－ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA－3′。推荐退火温度（Tm）53℃ 预期扩增片断大小为496bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

巴氏杆菌，根据参考文献中报道的巴氏杆菌荚膜基因设计引物［5］，上游引物5′－ATCCGCTATTTACCCAGTGG－3′， 下 游 引 物 5′－GCTGTAAACGAACTCGCCAC－3′。推 荐 退 火 温 度 （Tm）56℃。预期扩增片段大小为457bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

链球菌，根据参考文献中报道的链球菌荚膜多糖 基 因 设 计 引 物［6］，上 游 引 物：5′－GAAAAAGTCAGCATTATTGTA－3′，下 游 引 物 5′－TTAATCGTTGTTCTTTTCTTCCCTAATTAA－3′。 推荐退火温度（Tm）53℃，预期扩增片段387bp引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3.2 疑似菌落的PCR检测 挑取平板上的待检单菌落，接种于LB液体培养基中摇床过夜培养。取1mL菌液提取DNA作为模板，为减少漏检，提高检测效率，将3对引物放在同一反应体系里，对同一菌落进行多重PCR反应：

PCR mix：12.5μL，3对引物上游、下游引物Pl、P2（10pmol／μL）各1μL，菌液模板1μL，灭菌双蒸水7.5μL；反应条件为94℃预变性5min；94℃1min，53℃1min，72℃延伸1min，31个循环；72℃延伸10min。PCR产物于1.2g／L琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察结果。

1.2.3.3 PCR 产物的克隆、测序及序列分析PCR产物电泳回收后与pMDT－18质粒连接，按常规方法转化DH5α感受态细胞。挑取白色菌落接种LB液体培养基，37℃振摇过夜。将菌液进行PCR鉴定，将鉴定阳性菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。应用DNA Star软件将获得各种细菌特异性目标序列分别与GenBank中登录的其他序列进行同源性比较，以初步确定分离菌株属性。

2 结果

2.1 细菌分离的结果

2.1.1 疑似沙门菌分离菌株 在普通营养琼脂平板上，可见微小圆形、透明而略带灰白、湿润、边缘整齐、针尖大的露滴样菌落；在麦康凯琼脂平板上呈细小、无色半透明、光滑、圆整菌落，与猪沙门菌的培养特性相符［1］。

2.1.2 疑似多杀性巴氏杆菌分离菌株 在TSA加血清培养基上长成灰白、透明、光滑的中等大小菌落，对光照有蓝色荧光，瑞特染色两极着色，两端钝圆，与多杀性巴氏杆菌的培养特性相符［2］。

2.1.3 疑似链球菌分离菌株 选择性增菌后，划线分离在血琼脂平板上进行，37℃培养24h，血平板上长出灰白色、圆形、透明、表面光滑、边缘整齐 、针尖大的露滴样菌落，菌落周围出现直径约1mm的溶血环。革兰染色见阳性小球菌。与链球菌的培养特性相符［3］。

2.2 生化鉴定结果

2.2.1 疑似沙门菌的生化试验结果 生化试验结果表明，可疑菌发酵葡萄糖、木糖醇、赖氨酸、甘露醇、蔗糖、果糖、山梨醇；不发酵甘露糖；硫化氢、苯丙氨酸、尿素酶反应呈阴性，与猪沙门菌的生化特性一致［7］。

2.2.2 疑似多杀性巴氏杆菌的生化试验结果 可疑菌发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖；不发酵乳糖、麦芽糖；吲哚、硝酸盐、鸟氨酸脱羧酶试验均阳性；脲酶、枸橼酸、甲基红、VP试验均为阴性。可疑菌符合猪多杀性巴氏杆菌的生化特征［7］。

2.2.3 疑似链球菌的生化试验结果 可疑菌发酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇 ；不发酵木糖、菊糖、棉子糖、肌醇或反应弱；VP、MR以及吲哚试验均阳性。可疑菌符合猪链球菌的生化特征［7］。

2.3 PCR检测结果

取需鉴定的细菌液体培养物，将设计的沙门菌特异性组氨酸转运操纵子基因、巴氏杆菌特异性荚膜基因以及链球菌特异性荚膜多糖基因引物放在同一反应体系里，进行多重PCR扩增，扩增出了3个与预期的大小一致的各自细菌相应的PCR产物，分别见图1、图2、图3。

将PCR扩增的片段各自送一份测序，利用DNA Star软件与GenBank上登录的参考菌株序列进行比较，沙门菌同源性达99.5%～99.8%，巴氏杆菌同源性达99.6%～99.7%，链球菌同源性达99.5%～99.8%。

综合分析细菌分离、生化反应以及PCR鉴定结果，本研究共获得沙门菌19株，链球菌15株，巴氏杆菌12株。

图1 重组细胞组氨酸转运操纵子基因PCR产物Fig.1 The PCR products of reconstitution cell histine transport operon of Salmonella.

图2 待检巴氏杆菌荚膜基因PCR产物Fig.2 The PCR products of capsule of Pasteurella

图3 链球菌荚膜多糖基因PCR产物Fig.3 The PCR products of capsular polysaccharide of Streptococcus

3 讨论

考虑到目前养猪场普遍存在沙门菌、多杀性巴氏杆菌以及链球菌等多种病原菌单独或混合感染的情况，本文选择这3种细菌为重点分离目标菌对现场剖检病猪无菌采集病料，分别按3种病原菌的培养方法进行分离培养，结合生化试验及PCR检测，以鉴定细菌属性。初步摸清了3种病原菌在上海地区部分猪场的流行分布状况。

为了准确地鉴定分离培养所得的沙门菌、链球菌以及巴氏杆菌。本研究首先对可疑菌落进行生化反应鉴定，再对疑似菌落进一步利用PCR检测特异性基因片段，分别将扩增的3种细菌的基因片段序列与GenBank上登录的参考菌株序列进行比较。分离菌株中检出沙门菌组氨酸转运操纵子基因与GenBank上登录的其他沙门菌菌株组相应片段的同源性可达99.5%～99.8%；分离菌株中检出巴氏杆菌特异性荚膜基因与GenBank上登录的巴氏杆菌相应片段的同源性可达99.6%～99.7%；分离菌株中检出链球菌特异性荚膜多糖基因与GenBank上登录的链球菌相应片段的同源性可达99.5%～99.8%。说明本研究采用的引物在PCR体系中可以准确地检测各自的目的菌，与相关的文献［1－3］报道一致。本研究结果显示，生化试验鉴定结果与PCR检测结果符合率为100%，说明本试验采用的PCR鉴定细菌的方法是可行的。

本研究尝试用3种引物的多重PCR对同一菌落进行检测，既可以提高检出率，还简化了检测步骤，为最终建立快速、敏感、准确可靠的检测方法奠定了基础。

整个试验共解剖了31头猪，分离到了46株不同细菌菌株，其中一些猪只病料中分离到不止一种病原菌，说明混合感染情况的存在。本研究结果也为进一步全面研究上海地区养猪场主要流行病原菌积累了较为详细的资料。

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