绿头鸭卵黄硒含量与禽流感新城疫病毒抗体滴度关系探讨

陈雪龙，齐艳萍，2，杨焕民，王晓龙

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆163319；2.农业部农产加工品质量监督检验测试中心，黑龙江 大庆163319；3.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨150040）

禽流感（AI）和新城疫（ND）是分别由禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）引起的危害禽类的烈性传染病，因为AIV与NDV的影响极大，因此近年来关于病毒的发生、传播及变异备受关注。早在1918年美国流感暴发时，就发现缺硒地区病患死亡率高，因此将硒与病毒性疾病联系在一起。有研究发现，硒元素水平与病毒感染程度及其遗传变异有很大关系，如缺硒不仅增强流感感染的严重程度，还可促进病毒自身的遗传变异［1］。

绿头鸭（Anas platyrhynchos）属鸟纲，雁形目，鸭科，为我国常见候鸟，在大庆龙凤湿地内属于优势种群，被列入中国国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。本研究通过对绿头鸭进行卵黄硒含量，以及AIV、NDV抗体监测，来评价卵黄硒含量与病毒抗体的波动状态，评估两者之间的相关关系，为防控野禽病毒性传染病提供基础数据，同时为保护区管理工作提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 H1、H5、H9亚型禽流感及新城疫抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；10 mL／L鸡红细胞、抗凝剂、PBS、阳性对照鸡卵黄（采用免疫过的母鸡产后10d的卵）、阴性对照鸡卵黄（采用未免疫过的母鸡产后10d的卵）等试剂自制，硝酸、盐酸、高氯酸、氢氧化钠、硼氢化钠、铁氰化钾等。

1.2 方法

1.2.1 卵黄的硒含量检测 绿头鸭卵弃去卵清后，吸取0.2g卵黄，采用我国通用的食品硒含量检测方法（GB 5009.93－2010）中的氢化物原子荧光光谱法。

1.2.2 10mL／L鸡红细胞的制备 用长针刺入鸡翅下静脉，采血，50mL／L抗凝剂与全血的比例为1∶3～1∶4。向鸡血中加入2～3倍的PBS，1 500～3 000r／min离心5～8min，弃上清，洗4～5次。加入PBS制成10mL／L鸡红细胞悬液。

1.2.3 卵黄抗体的提取 将收集的绿头鸭卵、阳性对照鸡卵黄、阴性对照鸡卵黄弃去卵清，分别吸取200μL卵黄，加入800μLPBS，涡旋混匀器混匀后，3 000r／min离心10min，取上清待测。

1.2.4 血凝抑制试验 在微量反应板的1～12孔均加入25μLPBS，在第1孔加入25μL卵黄稀释液，混匀。从第1孔吸取25μL混合液加入第2孔，混匀后再吸取25μL加入第3孔，如此进行倍比稀释至第12孔，从第12孔吸取25μL弃去。第1～12孔均加入抗原，室温放置20min。在第1～12孔均加入10mL／L鸡血悬液，室温放置20min后，进行结果判定。其中阳性血清、阴性血清同待测样品一起进行倍比稀释，检测。

1.3 统计分析 检测结果利用Excel进行数据统计分析。

2 结果

经血凝抑制试验对 H1、H5、H9亚型AIV和NDV进行卵黄HI抗体滴度检测，在被检的105枚绿头鸭卵中，全部样本均携带H1亚型AIV抗体，阳性率为100%，其平均抗体滴度为6.17log2；有62个样本携带H5亚型AIV抗体，其阳性率为59.05%，平均抗体滴度为2.89log2；有75个样本携带H9亚型AIV抗体，其阳性率为71.43%，平均抗体滴度为3.34log2；有72个样本携带NDV抗体，其阳性率为68.57%，平均抗体滴度为4.22log2（见表1）。

表1 绿头鸭AIV不同亚型、NDV卵黄抗体滴度测定

通过氢化物原子荧光光谱法进行硒含量检测，被测的105枚卵的硒含量平均为0.48±0.15μg／g（见表2）。

表2 绿头鸭卵黄硒含量检测

通过相关关系分析，结果显示，H1、H5、H9亚型AIV抗体与卵黄硒含量的相关系数分别为：0.077、0.714、0.690，ND病毒抗体与卵黄硒含量的相关系数为0.611。经统计检验其中除H1亚型AIV抗体外，其余3种病毒抗体与卵黄硒含量均存在显著的正相关关系。

表3 绿头鸭卵黄硒含量与病毒抗体的相关关系

3 分析与讨论

大庆龙凤湿地鸟类资源丰富，据统计共有142种鸟类，其中国家Ⅰ级保护鸟类5种，Ⅱ级保护鸟类19种，省重点保护鸟类19种。由于龙凤湿地生态环境以芦苇沼泽为主，因此鸟类以游禽和涉禽占绝大部分。绿头鸭是龙凤湿地的优势物种，每年春季开始在此繁殖，秋季到南方越冬，因此，野鸟病毒性传染病的特点是随着候鸟或水禽的迁徙而使疾病呈世界性分布［2］。自1997年，香港首次发生H5N1亚型禽流感病毒致人感染、死亡的事件以来［3］，禽流感病毒致人感染的事件不断发生，自此开始人们更加关注野鸟的病毒性传染病的流行特点。加强候鸟迁徙路线附近的湿地、湖泊及候鸟聚集区和交汇区的流行病学调查，对世界禽类病毒性传染病疫情的实时监控和预警尤为重要［4］。如果亲鸟接触过AIV、NDV后，体内会产生抗体，其抗体可通过卵黄直接传递给雏鸟，使其在生命早期面临环境微生物侵袭时获得保护［5］，因此，卵黄抗体水平可以在一定程度上反映亲鸟的特异性病原体感染及其在繁殖环境中的病原体状况［6］。本研究对绿头鸭AIV和NDV的监测发现，随着病毒致病性的提高，绿头鸭种群中感染并痊愈个体的比例逐渐下降。致病性较低的H1亚型AIV阳性率100%，说明几乎所有绿头鸭均感染过；而致病性高的H5、H9亚型AIV和NDV阳性率也较高，说明所调查的范围内约有59.05%、71.43%和68.57%的绿头鸭可能曾经感染或接触过，但其病毒抗体滴度却很低，这将直接影响雏鸟抵抗病毒侵袭的能力。当母源抗体HI滴度为6log2左右时，其保护率为100%，在4log2时，其保护率为50%，在2log2时，其保护率为20%［7］。由此规律可以推断出，本地区100%雏鸟可以抵御H1亚型AIV的侵袭，而对于H5、H9亚型AIV和NDV来说，只有20%～50%的雏鸟可以与之对抗，因此说明在龙凤湿地野鸟大面积流行H5、H9亚型AI和ND的可能性很大。

硒是机体必需的微量元素之一，也是惟一与机体抗病毒有关的元素，已证实硒能提高畜禽的体液免疫和细胞免疫功能，增强机体的抗感染能力［8］。鸟类在产卵期会消耗体内大量的硒元素，从而引起机体严重缺硒，因此容易被高致病性病毒击垮。这一现象已有实例得到证实，硒、维生素E缺乏症可以导致产蛋鸡并发新城疫［9］。然而鸟类体内消耗的的硒会输入到卵中，以满足繁殖所需，所以卵中硒含量最高［10］。本试验绿头鸭卵黄硒含量为0.48±0.15μg／g，远远高于达到富硒鸡蛋的0.233μg／g的水平，说明绿头鸭能够在体内富集足够含量的硒元素并将其输入到卵中，以保证雏鸟生长、发育过程对硒的需求及抵抗病毒侵袭的能力。在我国，从东北到西南有45个贫硒地带，硒含量达到国际公布的正常临界值0.1mg／kg的地区只有1／3，即我国2／3地区为缺硒地区，每有疫情暴发几乎都在缺硒地带［11］。本地区虽然地处缺硒地区，但由于龙凤湿地保护区硒含量较高，加之绿头鸭食物充足，使得其体内能够富集足够含量的硒，这也在一定程度上提高了绿头鸭抵抗AIV和NDV的能力。在表3中，从硒含量与不同亚型AIV和NDV的相关关系可以看出，绿头鸭卵携带H1亚型AIV抗体现象较为普遍，且抗体滴度均较高，但在卵黄硒含量与H1亚型AIV抗体之间并无明显的相关关系，而硒含量与H5、H9亚型的AIV和NDV之间呈明显的正相关，即随着硒含量的升高，绿头鸭卵黄抗体也呈升高趋势，这也进一步说明了硒含量在鸟类抗病毒方面具有一定的积极作用，这一作用在不同动物的试验中也得到了一定程度的证实［12］。

对于湿地生态系统来说，湿地鸟类是其重要的组成部分，在湿地生态系统的能量流动和维持生态系统的稳定性方面起着举足轻重的作用，同时也是监测湿地环境质量及其敏感程度的生物指标。本研究针对绿头鸭卵黄AIV、NDV抗体及硒含量进行了一系列的调查，为监测野生水禽病毒性疾病的发生、流行，深入研究不同病毒抗体在龙凤湿地的分布及对人类的影响奠定基础，同时为保护区管理工作提供了一个新的方法。

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