骨碎补水提液对大鼠成骨细胞OPG mRNA表达的影响

赵晓燕，刘钟杰，李彩虹，李 琴，邢晓旭，田 丹，韩 博

（中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193）

骨碎补味苦、性温，入肝、肾经。始载于《本草拾遗》，主治肾虚腰痛，骨伤，风湿痹痛。是补肾中药中的佼佼者，与其他中药同等条件下作用于成骨细胞株，作用最为突出［1］。骨碎补多项临床及动物试验表明，其检验指标与骨保护素（OPG）互为联系［2］。本试验以大鼠成骨细胞为模型，假定骨碎补水提液能调节OPG mRNA的表达，且作用与雌激素受体通路相关。

1 材料与方法

1.1 药液制备 骨碎补饮片，购自北京同仁堂，将其和蒸馏水按1∶10（W∶V）的比例混合，文火加热沸腾25min，滤出药液后再加8倍蒸馏水煮沸25 min，合并两次滤液离心取上清液，旋转蒸发浓缩成浓度为2g／mL的生药液，调pH 值至7.2～7.4。临用前用DMEM完全培养液配制成不同浓度的骨碎补培养液，以不加药物的DMEM完全培养液作为对照组。

1.2 细胞培养、鉴定 新生24h内SD大鼠，购自北京兴隆实验动物场，参照吴培福方法，体外培养大鼠颅骨成骨细胞［3］。并通过形态学观察、瑞氏染色和钙化结节染色的方法对所培养的细胞进行鉴定，鉴定成骨细胞培养成功。

采用第3代细胞进行试验。细胞同步化后，试验组换为含不同浓度骨碎补水提液、阳性对照组换为含雌二醇完全培养液；阴性对照组换为完全培养液，或者试验组换含10mg／mL骨碎补水提液＋10－7mol／L ICI 182 780的完全培养液，作用48h后提取总mRNA。

1.3 细胞总 mRNA的提取 按照说明书，用Trizol法提取细胞总RNA。

1.4 RT－PCR 按照试剂盒说明书进行反转录，cDNA为模板进行基因扩增，引物序列见表1，产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

表1 大鼠成骨细胞中β－actin、OPG引物序列

1.5 目的基因的克隆制备 按照说明书对PCR产物进行纯化、回收。回收产物与pEASY－T3载体连接后，转化到感受态细胞中，挑取阳性克隆，37℃ 摇床过夜培养后菌液送检测序，用质粒提取试剂盒提取阳性菌液质粒。

1.6 β－actin、OPG标准曲线构建和不同组成骨细胞中基因水平的检测 构建这2个基因的标准曲线，以不同处理的成骨细胞cDNA作为模板，用荧光定量PCR对基因进行检测，通过标准曲线计算得出OPG的表达水平。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05显著性差异，P＜0.01极显著性差异。所有数据均以平均数±标准差表示。

2 结果

不同浓度骨碎补水提液作用于成骨细胞48h后，10mg／mL组、1mg／mL组、0.1mg／mL组显著促进OPG基因水平的表达，其中10mg／mL组作用与雌二醇组差异不显著；0.01mg／mL、0.001 mg／mL促进作用不显著，见图1。

10mg／mL骨碎补水提液与雌激素受体抑制剂一同作用于成骨细胞后，促进OPG基因水平表达的作用受到抑制，见图2。

3 讨论

骨骼是代谢活跃的器官，在整个生命过程中都在进行着吸收与重建。这个过程受成骨细胞的调控：成骨细胞表达NF－κB受体活化因子配体（RANKL）与破骨细胞前体细胞表面上的NF－κB受体活化因子（RANK）结合，促进破骨细胞的分化及骨吸收；同时成骨细胞还分泌OPG，与RANKL竞争性结合，从而抑制RANKL和RANK之间的作用，以防止骨吸收过度。因此OPG、RANKL任何一方的改变都能影响骨吸收或重建的进程。

廖悦华等通过动物试验证明，骨碎补能抑制激素缺乏引起的骨流失，对糖皮质激素引起的骨质疏松也有一定作用［4－6］。大量细胞试验证明，骨碎补提取物及其主要成分对成骨细胞或骨髓基质细胞的增殖、分化及钙化均有促进作用［7－9］。有试验证明，骨碎补提取物抑制破骨细胞性骨吸收［10］。种种迹象表明，骨碎补是治疗骨质疏松的有效药物。有试验证明，以骨碎补主要成分的骨灵片能显著提高去势小鼠血清中OPG／RANKL比值［11］。本试验中，一定浓度的骨碎补作用于成骨细胞，高剂量组显著促进OPG基因水平的表达，低剂量组促进作用不显著。证明骨碎补水提液能增高大鼠成骨细胞内基因水平OPG的表达，且呈剂量依赖关系。推测，骨碎补主要通过作用于OPG影响OPG／RANKL／RANK系统，进而影响破骨细胞的增殖分化。

本试验中，雌激素受体抑制剂与骨碎补共同作用于成骨细胞后，骨碎补促进OPG表达作用受到抑制，与骨碎补单独培养差异显著。因此，雌激素受体通路至少是骨碎补促进OPG基因表达，增高OPG／RANKL比值的通路之一。周继凯试验证明，骨碎补促进小鼠成骨细胞增殖、分化是通过雌激素受体通路［12］。骨碎补通过雌激素通路对成骨细胞起作用，由此可以推测其为潜在的植物性雌激素。对骨碎补详细的机制研究有助于其在临床上的应用。

［1］Chang E J，Lee W J，Cho S H，et al.Proliferative effects of flavan－3－ols and propelargonidins from rhizomes of Drynaria fortunei on MCF－7and osteoblastic cells［J］.Arch Pharm Res，2003，26（8）：620－630.

［2］刘钟，郭梁，吴亚东，等.骨碎补总黄酮作用于 OPG／RANKL／RANK轴系统的相关研究［J］.中华中医药学刊，2010（2）：271－274.

［3］吴培福，钟代彬，曲伟杰，等.小鼠成骨细胞改良酶的消化分离培养［J］.甘肃农业大学学报，2004（5）：512－515.

［4］廖悦华，梁琼，王卓，等.中药骨碎补对去睾丸骨质疏松症动物模型的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2007，13（4）：277－280.

［5］贾红蔚，王宝利，邝晨钟，等.骨碎补与雌激素对去卵巢大鼠骨质疏松作用的对照研究［J］.中国中西医结合杂志，2006（S1）：116－119.

［6］马克昌，高子范，张灵菊，等.骨碎补对大白鼠骨质疏松模型的影响［J］.中医正骨，1992（4）：3－4.

［7］邓展生，张璇，邹冬青，等.骨碎补各种提取成分对人骨髓间充质干细胞的影响［J］.中国现代医学杂志，2005，15（16）：4.

［8］唐琪，陈莉丽，严杰.骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株MC3T3－E1细胞增殖、分化和钙化作用的研究［J］.中国中药杂志，2004，29（2）：5.

［9］徐展望，张建新，李军，等.骨碎补提取液对兔骨髓基质细胞增殖的影响［J］.中医正骨，2005，17（4）：3.

［10］樊粤光，黄永明，曾意荣，等.骨碎补提取液对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用［J］.中国中医骨伤科杂志，2003（6）：6－8.

［11］曹艳艳，李娟，杨春莉，等.骨灵片对骨质疏松大鼠血清opg／Rankl、Picp和相关细胞因子的影响［J］.热带医学杂志，2007，7（7）：4.

［12］周继凯，李焕德.2－骨碎补促成骨细胞分化作用的机制研究：湖南省药学会第12次会员代表大会暨2008年学术年会［C］.长沙：2008.